PSMA增強(qiáng)子-啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)shRNA靶向干擾核干因子治療前列腺癌的研究.pdf

1、本文就PSMA增強(qiáng)子/啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)shRNA靶向干擾核干因子治療前列腺癌進(jìn)行了研究，主要從以下幾個(gè)部方展開(kāi)： 第一部分靶向干擾EGFP的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 目的：采用不同終止信號(hào)構(gòu)建前列腺特異性膜抗原增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(PSMAe/p)調(diào)控的靶向EGFP的shRNA真核表達(dá)重組質(zhì)粒pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)，pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)和pPSMAe/p-shEGF

2、P-poly(U)。方法：分別使用pSilencerTM4.1-CMVneo質(zhì)粒中RNA聚合酶II啟動(dòng)子的終止信號(hào)poly(A)，minipoly(A)(AAUAAA六聚體)，RNA聚合酶III啟動(dòng)子終止信號(hào)poly(U)(TTTTTT)為終止信號(hào)，采用分子克隆技術(shù)將人工合成的含靶向EGFP的shRNA(EGFP-shRNA)及終止信號(hào)序列的DNA片段定向克隆入SalI、BamH雙酶切的含有PSMA增強(qiáng)子/啟動(dòng)子基因序列的質(zhì)粒載體pPS

3、MAe/p上。重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測(cè)序進(jìn)行鑒定。結(jié)果：通過(guò)菌液PCR，質(zhì)粒酶切和測(cè)序鑒定，人工合成的DNA序列成功插入載體pPSMAe/p上，插入目的基因的真核表達(dá)載體的酶切圖譜和測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。結(jié)論：成功構(gòu)建了采用不同終止信號(hào)，以前列腺特異性膜抗原增強(qiáng)子/啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的靶向干擾EGFP的shRNA真核質(zhì)粒表達(dá)載體pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)，pPSMAe/p-shEGFP-minipoly(A)

4、pPSMAe/p-shEGFP-poly(U)。 第二部分PSMAe/p驅(qū)動(dòng)shRNA靶向干擾EGFP的細(xì)胞特異性研究 目的：探討前列腺特異性膜抗原增強(qiáng)子、啟動(dòng)子(PSMAe/p)驅(qū)動(dòng)shRNA轉(zhuǎn)錄效果和細(xì)胞特異性，比較何種終止序列更有效。方法：通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)，將各重組干擾質(zhì)粒與pEGFP-C1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染高表達(dá)PSMA的人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、不表達(dá)PSMA的人前列腺癌細(xì)胞系PC

5、-3、不表達(dá)PSMA的人膀胱癌細(xì)胞系EJ和人胚腎HEK293細(xì)胞，采用熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblot檢測(cè)EGFP在各組細(xì)胞中的干擾效果。結(jié)果：熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示：各干擾質(zhì)粒與pEGFP-C1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染LNCaP后，各干擾組熒光表達(dá)均有不同程度減少，與空載體組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)組減少與pPSMAe/p-

6、shEGFP-minipoly(A)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，和pPSMAe/p-shEGFP-poly(U)組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。各干擾載體與pEGFP-C1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PC-3、EJ和HEK293細(xì)胞后各組熒光表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，EGFPmRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異；LNCaP細(xì)胞各干擾組中EGFPmRNA和蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均有不同程度下降，以pPSMAe/p-shEGFP-poly(

7、A)組最為明顯。結(jié)論：PSMAe/p能在高表達(dá)PSMA的LNCaP細(xì)胞中特異性驅(qū)動(dòng)shRNA轉(zhuǎn)錄，而在不表達(dá)PSMA的PC-3細(xì)胞、EJ細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中未能有效驅(qū)動(dòng)shRNA轉(zhuǎn)錄；在三種終止信號(hào)中poly(A)信號(hào)終止轉(zhuǎn)錄最有效。 第三部分PSMAe/p驅(qū)動(dòng)shRNA靶向干擾核干因子治療前列腺癌的研究 目的：進(jìn)一步探討PSMAe/p驅(qū)動(dòng)shRNA靶向干擾NS基因的細(xì)胞特異性；通過(guò)RNA干擾觀察NS基因沉默對(duì)前列腺

8、癌細(xì)胞和裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響，探討NS基因與前列腺癌惡性增殖的關(guān)系，為前列腺癌的基因治療探索新的靶基因和靶向策略。方法：免疫組化檢測(cè)人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC-3中NS表達(dá)；合成以poly(A)為終止信號(hào)的針對(duì)NS基因的shRNA對(duì)應(yīng)模版的DNA序列，定向克隆入SalI、BamHI雙酶切的pPSMAe/p-shEGFP-poly(A)的載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPSMAe/p-shNS-poly(A)。脂質(zhì)體Lipofectamine

9、TM2000介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人前列腺癌LNCaP和PC-3細(xì)胞系中。采用半定量RT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)干擾后NSmRNA和蛋白水平表達(dá)的變化，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡變化情況。以LNCaP細(xì)胞構(gòu)建裸鼠前列腺癌移植瘤模型，腫瘤局部多點(diǎn)注射重組干擾質(zhì)粒，觀測(cè)治療過(guò)程中腫瘤體積和測(cè)量最終重量，免疫組織化學(xué)染色法觀察各組中NS蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC-3中

10、均表達(dá)NS蛋白；經(jīng)過(guò)酶切及測(cè)序鑒定成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPSMAe/p-shNS-poly(A)。在LNCaP細(xì)胞中NS基因表達(dá)水平下調(diào)，細(xì)胞增大，胞膜邊緣突起增多，更趨向于分化；S期細(xì)胞的百分率降低，G1期的百分率升高；細(xì)胞的體外增殖速率明顯降低，細(xì)胞凋亡增多。在PC-3細(xì)胞中NS基因表達(dá)無(wú)明顯下調(diào)，細(xì)胞周期和增殖能力無(wú)明顯變化。LNCaP細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)速度、腫瘤體積和最終重量也明顯降低。結(jié)論：PSMAe/p驅(qū)動(dòng)shRNA靶向干擾NS基因