產(chǎn)酶溶桿菌的次級(jí)代謝調(diào)控機(jī)制和三株鏈霉菌的化學(xué)成分研究.pdf

1、微生物一直是天然藥物的重要來源。自從青霉素問世至今的不到100年時(shí)間里，已經(jīng)有大量的各種生理活性的抗生素被發(fā)現(xiàn)，這些藥物為人類的健康做出了不可磨滅的貢獻(xiàn)。DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)表以后，分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等生物技術(shù)獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，人們開始在基因水平上認(rèn)識(shí)微生物產(chǎn)生各種抗生素的機(jī)理。迄今已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)報(bào)道了抗生素的生物合成機(jī)制及其調(diào)控機(jī)制。
　　產(chǎn)酶溶桿菌Lysobacter enzymogenes合成多種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的抗生素，但是其調(diào)控

2、機(jī)制仍不是十分清楚。本學(xué)位論文研究鑒定了5個(gè)脂肪酸類的擴(kuò)散性信號(hào)分子(diffusible signal factor, DSF)(LeDSFs)，產(chǎn)酶溶桿菌只有在小規(guī)模發(fā)酵菌液OD值達(dá)到一定濃度時(shí)才會(huì)產(chǎn)生LeDSFs。論文通NMR、MS、IR等手段鑒定了這5個(gè)LeDSFs的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)LeDSFs能夠上調(diào)HSAF生物合成基因簇pks/nrps的表達(dá)，提高HSAF的產(chǎn)量。作用機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，LeDSFs上調(diào)clp基因的表達(dá)，該基因編碼了全局

3、性調(diào)控因子Clp(cAMP receptor-like protein)，clp阻斷的突變株不會(huì)產(chǎn)生HSAF，表明LeDSFs通過全局性調(diào)控蛋白Clp調(diào)控HSAF的生物合成基因簇。在產(chǎn)酶溶桿菌L.enzymogenes基因簇中，包含了潛在的LeDSF生物合成基因rpf。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LeDSFs的生物合成和rpfB(編碼acyl-CoA synthetase)和rpfF(編碼3-hydroxyacyl-ACP dehydratase/t

4、hioesterase)有關(guān);rpf基因簇中還包含編碼雙組分調(diào)控系統(tǒng)的rpfC/rpfG基因。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，LeDSFs對(duì)HSAF生物合成的調(diào)控作用是通過雙組分調(diào)控系統(tǒng)RpfC/RpfG實(shí)現(xiàn)的。該研究發(fā)現(xiàn)了新型DSF類信號(hào)分子，并且首次闡述其調(diào)控HSAF生物合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　產(chǎn)酶溶桿菌中有54套編碼雙組分調(diào)控系統(tǒng)的基因。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有一段qseC/qseB的同源基因編碼QseC/QseB雙組分調(diào)控系統(tǒng);在培養(yǎng)

5、基中添加QseC抑制劑LED209，L.enzymogenes產(chǎn)生大量的吲哚;敲除Le-qseC基因或Le-qseB基因的突變株也能產(chǎn)生大量吲哚。因此，吲哚可能是QseC的激動(dòng)劑。使用吲哚為識(shí)別基團(tuán)、熒光素為報(bào)告集團(tuán)的熒光探針，觀察到該探針與L.enzymogenes細(xì)胞結(jié)合，初步證實(shí)吲哚是QseC的激動(dòng)劑。QseC在革蘭氏陰性菌中廣泛存在，它可以調(diào)控諸如毒性、運(yùn)動(dòng)性等多種性狀。在大腸桿菌中，腎上腺素/去甲腎上腺素和AI-3是可以被Qs

6、eC識(shí)別的信號(hào)分子。但是AI-3的化學(xué)結(jié)構(gòu)至今未見報(bào)道，僅推測(cè)它是一個(gè)含氮芳香化合物。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吲哚極有可能是AI-3類信號(hào)分子。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，吲哚通過Le-QseC/QseB雙組分調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)控了產(chǎn)酶溶桿菌L.enzymogenes中HSAF的生物合成和細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性，促進(jìn)了HSAF生物合成有關(guān)的pks/nrps及后修飾酶基因的轉(zhuǎn)錄。這是首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)過QseC/QseB雙組分調(diào)控系統(tǒng)傳遞調(diào)控信號(hào)的信號(hào)分子。對(duì)于今后更深入了解Qse

7、C/QseB雙組分調(diào)控系統(tǒng)的作用、設(shè)計(jì)新型的QseC抑制劑提供了借鑒意義。該研究也為抗生素工業(yè)優(yōu)化發(fā)酵條件提高抗生素產(chǎn)量提供了參考。
　　本論文還在產(chǎn)酶溶桿菌中分離得到了兩個(gè)DF類信號(hào)分子，研究發(fā)現(xiàn)該分子可以提高pks/nrps的轉(zhuǎn)錄水平并提高HSAF產(chǎn)量。但是其具體的調(diào)控途徑未知。
　　本學(xué)位論文還對(duì)3株鏈霉菌的化學(xué)成分進(jìn)行了研究。從鏈霉菌Streptomycessp.S035菌株中分離得到了5個(gè)結(jié)構(gòu)奇特的26元環(huán)內(nèi)酰胺S

8、35-6R、S35-7R、S35-8R、S35-9R和S35-12R，以及一個(gè)已知化合物tripartilactam，這些化合物有罕見生物合成起始單元3-氨基-2-甲基丙酸。生物信息學(xué)分析表明，S035菌株基因組中有與化合物vicenistatin生物合成基因簇非常相似的基因，以此為參考推測(cè)了tripartilactam的生物合成途徑。Tripartilactam含有一個(gè)四元環(huán)，UV光照發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)，通過σ-遷移使四元環(huán)擴(kuò)環(huán)生成5個(gè)含

9、六元環(huán)的化合物，表明tripartilactam可能不是分離過程中形成的人工產(chǎn)物，S035菌株應(yīng)該有相應(yīng)的酶催化[2+2]環(huán)化反應(yīng)。
　　在海洋鏈霉菌Streptomyces sp.M10946分離得到了一個(gè)新的pyrrolo[1，4]benzodiazepine類化合物以及3個(gè)已知化合物cyclo(D)-Pro-(D)-Val，cyclo(D)-Pro-(D)-Leu和limazepine A。實(shí)驗(yàn)通過NMR、MS等手段鑒定了化

10、合物的結(jié)構(gòu)，并研究了其抗菌和細(xì)胞毒活性，發(fā)現(xiàn)4個(gè)化合物都沒有抗菌活性，但是都具有微弱的細(xì)胞毒性。
　　對(duì)AHBA合酶基因陽性鏈霉菌Streptomyces sp.S010的20 L燕麥瓊脂培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了分離，共得到3個(gè)已知化合物，放線菌素V、D和I，并未得到預(yù)期的安莎霉素類化合物，論文對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行了基因水平的分析。
　　綜上所述，論文在產(chǎn)酶溶桿菌中分離得到了8個(gè)信號(hào)分子類化合物，并系統(tǒng)研究了它們調(diào)控抗生素HSAF生物