CREG通過(guò)p38-JNK絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞凋亡.pdf

1、研究背景和目的：
　　細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定的生理或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自我結(jié)束生命的死亡方式。凋亡是細(xì)胞在一系列凋亡誘導(dǎo)因素的作用下，相關(guān)的凋亡信號(hào)通路被激活，使凋亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)發(fā)生改變，進(jìn)而在Ca2+、Mg2+的參與下激活相關(guān)酶而啟動(dòng)的。近年研究發(fā)現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）作為構(gòu)成血管壁的重要成分，其凋亡參與了動(dòng)脈粥樣硬化（AS）及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）術(shù)后再狹窄（RS）、高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程

2、。VSMCs凋亡是AS和血管成形術(shù)后RS的重要病理特征，提示細(xì)胞凋亡在AS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用。因此，有關(guān)VSMCs凋亡的研究已經(jīng)成為心血管疾病防治研究的熱點(diǎn)，深入探討調(diào)控VSMCs凋亡的分子機(jī)制具有重要的臨床意義，可能成為預(yù)防AS進(jìn)展和PCI術(shù)后RS的有效策略。
　　E1A激活基因阻遏子（cellular repressor of E1A-activated genes，CREG）是新近發(fā)現(xiàn)的一種分泌型糖蛋白，在組織

3、和細(xì)胞發(fā)育中起重要作用。已有研究表明，CREG蛋白在成熟的組織和細(xì)胞中高表達(dá)，而在未成熟的細(xì)胞如干細(xì)胞、人畸胎瘤細(xì)胞及未分化的VSMCs中呈低表達(dá)，說(shuō)明CREG對(duì)于維持機(jī)體細(xì)胞和組織的成熟和穩(wěn)態(tài)具有重要的作用。我室前期研究發(fā)現(xiàn)CREG過(guò)表達(dá)能夠?qū)归L(zhǎng)期血清饑餓誘導(dǎo)的VSMCs凋亡，而抑制CREG表達(dá)后，細(xì)胞不耐受去血清培養(yǎng)而發(fā)生大量凋亡。本研究以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染CREG過(guò)表達(dá)及表達(dá)抑制的人VSMCs和球囊損傷的人胸廓內(nèi)動(dòng)脈（ITA）為

4、研究對(duì)象，深入探討CREG在調(diào)控人VSMCs凋亡中的作用及相關(guān)分子機(jī)制，以期為PCI術(shù)后RS的防治提供新的思路和治療方法。
　　材料和方法：
　　我們首先應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，分別將過(guò)表達(dá)hCREG的pLNCX2-CREG和能夠沉默hCREG表達(dá)的pSM2-siCREG感染體外培養(yǎng)的人VSMCs。通過(guò)抗性藥物篩選，獲得能夠穩(wěn)定傳代的hCREG過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（hVSMCs-CREG）和hCREG表達(dá)抑制的細(xì)胞株（hVSMCs-si

5、CREG）。Westernblot鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的CREG表達(dá)，為進(jìn)一步探討CREG調(diào)控VSMCs凋亡等生物學(xué)行為提供研究平臺(tái)。
　　應(yīng)用已構(gòu)建的CREG過(guò)表達(dá)和表達(dá)抑制的hVSMCs，分別給予凋亡誘導(dǎo)劑斯托斯普林（Staurosporine，STS）和依托泊苷（Etoposide，VP-16）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，采用Westernblot、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和TUNEL染色等實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況和相關(guān)信號(hào)通路變化。并通過(guò)細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

6、和添加有關(guān)信號(hào)通路抑制劑進(jìn)一步明確CREG調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　在體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇患冠心?。–AD）并行冠脈搭橋手術(shù)病人的ITA建立球囊損傷模型，在球囊損傷和外源性添加CREG蛋白干預(yù)后的不同時(shí)間點(diǎn)收取受損動(dòng)脈段。采用蘇木精-曙紅染色觀察CREG和細(xì)胞凋亡標(biāo)志物cleavedcaspase-3變化情況。Westernblotting檢測(cè)CREG、VSMCs分化及凋亡指標(biāo)和相關(guān)信號(hào)通路的變化。并給予特異性信號(hào)通路抑

7、制劑，進(jìn)一步明確在血管組織急性損傷的情況下CREG調(diào)控細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路。
　　研究結(jié)果：
　　1、CREG過(guò)表達(dá)促進(jìn)VSMCs分化，抑制細(xì)胞凋亡
　　逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)CREG基因表達(dá)前后三種hVSMCs的形態(tài)學(xué)發(fā)生變化：pLNCX(＋)/GFP穩(wěn)定感染細(xì)胞（Ctlcells）呈典型的波峰波谷樣生長(zhǎng)；CREG過(guò)表達(dá)細(xì)胞（CREG-SNcells）體積變小且更加細(xì)長(zhǎng)，易于環(huán)繞排列生長(zhǎng)呈管腔樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的分化表型生長(zhǎng)

8、；CREG表達(dá)抑制細(xì)胞（CREG-AScells）體積明顯增大，細(xì)胞失去極性呈無(wú)序樣生長(zhǎng)。采用Westernblot檢測(cè)CREG-SN、Ctl和CREG-AS三種細(xì)胞的CREG表達(dá)及分泌情況。發(fā)現(xiàn)CREG-SN細(xì)胞胞漿中CREG的表達(dá)與Ctl細(xì)胞無(wú)明顯差別，而培養(yǎng)上清中表達(dá)較Ctl細(xì)胞明顯增加。CREG-AS細(xì)胞與前兩組細(xì)胞比較，培養(yǎng)上清及胞漿中CREG的表達(dá)明顯降低（P<0.01）。
　　分別選擇不同濃度的STS（50、100、

9、200nmol/L）、VP-16（20、50、100μmol/L）作用于CREG-AS細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)（0、4、8、12、24h）收集細(xì)胞。AnnexinV/PI雙染色流式細(xì)胞分析顯示：不同濃度的STS和VP-16對(duì)細(xì)胞凋亡均有作用，且其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)具有時(shí)間和濃度依賴性，即隨濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡的效應(yīng)越明顯。其中STS200nmol/L和VP-16100μmol/L誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果最為明顯。
　　CREG-SN、

10、Ctl和CREG-AS細(xì)胞分別在有效濃度的STS和VP-16誘導(dǎo)下，通過(guò)Westernblot檢測(cè)CREG、細(xì)胞分化和凋亡指標(biāo)表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VSMCs分化標(biāo)記物SMα-actin和SMMHC的表達(dá)趨勢(shì)與CREG相似，而凋亡標(biāo)志物cleavedcaspase-3及細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）和層粘連蛋白（Laminin-1，LN）與CREG表達(dá)趨勢(shì)相反。同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)，在CREG表達(dá)抑制組，cl

11、eavedcaspase-3的增高更明顯，SMα-actin和SMMHC的減少更為突出，而CREG過(guò)表達(dá)明顯抑制了細(xì)胞凋亡標(biāo)志物的表達(dá)，分化指標(biāo)表達(dá)水平卻相對(duì)較高。Annexin-V/PI雙染流式分析和TUNEL染色也發(fā)現(xiàn)CREG過(guò)表達(dá)明顯抑制細(xì)胞凋亡。以上結(jié)果提示，CREG過(guò)表達(dá)在維持hVSMCs分化狀態(tài)的同時(shí)，抑制其凋亡。
　　2、CREG通過(guò)p38/JNK信號(hào)通路調(diào)控VSMCs凋亡
　　三種細(xì)胞在STS和VP-16作用

12、下，在不同時(shí)間點(diǎn)，采用Westernblot檢測(cè)細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)磷酸化的p38、JNK和Akt均有增高趨勢(shì)。然后在分別給予信號(hào)通路抑制劑SB203580、SP600125和LY294002預(yù)處理的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)Annexin-V/PI流式分析，發(fā)現(xiàn)p38/JNK信號(hào)通路參與調(diào)控了VSMCs凋亡，而PI3K?Akt信號(hào)通路無(wú)明顯作用。為進(jìn)一步明確p38信號(hào)通路在CREG調(diào)控VSMCs凋亡中的作用，在CREG-A

13、S細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染p38表達(dá)抑制腺病毒質(zhì)粒和給予特異性p38抑制劑，通過(guò)流式分析和Westernblot分析進(jìn)一步明確了p38在細(xì)胞凋亡中的作用，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在p38活化的同時(shí)，進(jìn)一步激活了JNK，兩者在調(diào)控VSMCs凋亡中存在協(xié)同作用。
　　3、在急性損傷的動(dòng)脈模型中，CREG促進(jìn)VSMCs分化，同時(shí)通過(guò)p38/JNK信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡
　　體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在人ITA球囊損傷修復(fù)過(guò)程中CREG表達(dá)與VSMCs分化狀態(tài)相關(guān)。We

14、sternblot結(jié)果顯示，CREG在AS組織中低度表達(dá)，在球囊損傷后7d，CREG表達(dá)下降，到第14d和28d表達(dá)略升高，始終維持在低表達(dá)水平。VSMCs分化標(biāo)記物SMα-actin和SMMHC的表達(dá)趨勢(shì)與CREG相似，而細(xì)胞凋亡標(biāo)記物cleavedcaspase-3與CREG表達(dá)趨勢(shì)相反。在給予CREG蛋白干預(yù)后血管中CREG維持在高表達(dá)水平，SMα-actin和SMMHC也明顯增加并維持在高度表達(dá)水平，而cleavedcaspas

15、e-3表達(dá)明顯下降。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示cleavedcaspase-3在球囊損傷后28d明顯增高，而在給予CREG蛋白干預(yù)后，其表達(dá)水平明顯下降。HE染色也顯示在球囊損傷后28d新生內(nèi)膜明顯增厚，而CREG蛋白干預(yù)后，明顯抑制了損傷后新生內(nèi)膜的形成。以上結(jié)果提示在血管組織急性損傷修復(fù)過(guò)程中CREG可能在促進(jìn)VSMCs分化，抑制細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。
　　Westernblot也顯示，在急性損傷后，盡管總的p38、JNK和Ak

16、t表達(dá)沒(méi)有明顯改變，但在損傷后14d磷酸化的p38、JNK和Akt表達(dá)明顯增加。在外源性添加不同濃度的CREG蛋白干預(yù)后，p38、JNK和Akt活化形式的表達(dá)量明顯減低。與此同時(shí)，分別給予p38、JNK和Akt信號(hào)通路抑制劑，結(jié)果顯示在p38抑制劑組中磷酸化的p38和JNK表達(dá)均明顯下降，在JNK抑制劑組中磷酸化形式的JNK明顯減少，而p38的活化亦有所減低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)p38和JNK抑制劑組中細(xì)胞凋亡指標(biāo)cleavedcaspase-3表