Abl—Abi-1—WAVE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、目的：證明Abl—Abi-1—WAVE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的存在并研究其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機(jī)制方法：為證明Abl—Abi-1—WAVE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的存在并研究其在癌細(xì)胞極化運(yùn)動(dòng)中的作用及作用機(jī)制，我們?cè)谝詅ibronectin（FN）刺激黑色素瘤B16細(xì)胞產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)的模型中檢測(cè)Abi-1/WAVE2復(fù)合物，采用定位突變法證明Abi-1與WAVE2直接結(jié)合并闡明其結(jié)合位點(diǎn)；以用于侵襲性研究的經(jīng)典細(xì)胞系—黑色素瘤細(xì)胞系B16為研究對(duì)象，

2、以fibronectin（FN）刺激B16細(xì)胞使之發(fā)生極化運(yùn)動(dòng)（生成細(xì)胞扇形偽足）為研究模型，研究Abl/Abi-1/WAVE2在細(xì)胞極化運(yùn)動(dòng)中的作用及對(duì)肌動(dòng)蛋白聚合的影響，并用定點(diǎn)突變法闡明其作用機(jī)制；還采用RNA干擾技術(shù)使B16細(xì)胞中的Abi-1蛋白表達(dá)缺失，進(jìn)而觀察其對(duì)細(xì)胞伸展和移動(dòng)的影響。
　　 為研究Abl—Abi-1—WAVE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，我們采用共聚焦顯微鏡觀察Abl/Abi-1/WAVE2

3、在細(xì)胞有絲分裂末期的胞質(zhì)分裂過(guò)程中的定位，并采用RNA干擾技術(shù)使鼠NIH3T3細(xì)胞及人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的Abi-1蛋白表達(dá)缺失，觀察Abi-1蛋白穩(wěn)定缺失對(duì)細(xì)胞增殖的影響，并初步探討Abi-1蛋白缺失后所引起的P53、CDC25、CDK1及CyclinB1表達(dá)的改變；采用軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察MCF-7細(xì)胞Abi-1穩(wěn)定缺失后細(xì)胞克隆形成情況，并用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Abi-1穩(wěn)定缺失對(duì)細(xì)胞成瘤情況的影響。
　　 結(jié)果：在證明

4、Abl—Abi-1—WAVE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的存在并研究其在癌細(xì)胞極化運(yùn)動(dòng)中的作用及作用機(jī)制部分，(1)在以fibronectin（FN）刺激黑色素瘤B16細(xì)胞產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)的模型中檢測(cè)到Abi-1/WAVE2復(fù)合物，采用定位突變法證明 Abi-1的coiled-coil結(jié)構(gòu)域中的特定部位直接與 WAVE2 N端的WHD結(jié)構(gòu)域相結(jié)合；(2)以用于侵襲性研究的經(jīng)典細(xì)胞系—黑色素瘤細(xì)胞系B16為研究對(duì)象，利用fibronectin（FN）刺激黑色素

5、瘤細(xì)胞B16產(chǎn)生極化運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Abi-1使WAVE2由胞漿移位到細(xì)胞偽足扇形邊緣，并介導(dǎo)肌動(dòng)蛋白在該部位聚合形成膜皺褶和扁平偽足；當(dāng)WAVE2的WHD結(jié)構(gòu)域被去掉，則Abi-1/WAVE2的結(jié)合遭到破壞，此時(shí)Abi-1在胞漿中呈點(diǎn)狀分布，而WAVE 2幾乎全部進(jìn)入細(xì)胞核，在此狀態(tài)下的細(xì)胞即使接受FN刺激也不發(fā)生極化運(yùn)動(dòng)研究；(3)Abl存在于Abi-1/WAVE2復(fù)合物中，在細(xì)胞極化運(yùn)動(dòng)中，Abl/Abi-1/WAVE2與Rac

6、1和actin一起共定位于細(xì)胞頭部膜邊緣，用定點(diǎn)突變法掉WAVE2的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，表明Abi-1介導(dǎo)Abl對(duì)WAVE2的Y150位點(diǎn)磷酸化，體外肌動(dòng)蛋白聚合試驗(yàn)表明這種磷酸化在WAVE2活性調(diào)控中起促進(jìn)作用；(4)采用RNA干擾技術(shù)使B16細(xì)胞中的Abi-1蛋白表達(dá)缺失時(shí)，WAVE2在偽足頭部聚集減少，B16F1細(xì)胞伸展面積減少，且細(xì)胞膜呈毛刺狀。
　　 在研究Abl—Abi-1—WAVE2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用

7、部分，(1)共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Abl、Abi-1、WAVE2、CDK1以及actin共定位于細(xì)胞胞質(zhì)分裂過(guò)程中的收縮環(huán)形成部位，(2)采用RNA干擾技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，且不發(fā)生明顯的細(xì)胞凋亡；(3)RNA干擾使鼠NIH3T3細(xì)胞及人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的Abi-1蛋白穩(wěn)定缺失時(shí)，可見(jiàn)NIH3T3和MCF-7細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的多倍體和異倍體細(xì)胞；(4)Abi-1蛋白缺失后所引起P53表達(dá)明顯增多、CDC2

8、5表達(dá)減少、CDK1-15p表達(dá)減少，CyclinB1主要分布于多倍體細(xì)胞的胞漿中，且多倍體和異倍體細(xì)胞的Ki-67高表達(dá)；(5)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，具有多核細(xì)胞的Abi-1缺失細(xì)胞株與對(duì)照組MCF-7細(xì)胞在軟瓊脂上形成的克隆數(shù)無(wú)明顯差異，但95%的Abi-1穩(wěn)定缺失株的克隆為多核克隆，而對(duì)照組MCF-7細(xì)胞株多核克隆不足1%；裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明Abi-1穩(wěn)定缺失后細(xì)胞可以成瘤，且瘤體積和重量高于對(duì)照組MCF-7細(xì)胞株。