耐鹽基因SeNHX1在煙草中的表達(dá)研究.pdf

1、SeNHX1基因是從鹽生植物鹽角草中（Saliconia europaea L.）克隆得到的液泡型Na+/H+逆向運(yùn)輸?shù)鞍谆?，其表達(dá)的Na+/H+逆向運(yùn)輸?shù)鞍锥ㄎ辉谝号菽ど稀Ｒ号菪蚇a+/H+逆向運(yùn)輸?shù)鞍卓蓪⒓?xì)胞質(zhì)中的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中，其在維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)離子平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)酸堿度和維持細(xì)胞滲透壓等方面發(fā)揮著重要作用。在前期研究工作中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)煙草進(jìn)行耐鹽基因 SeNHX1轉(zhuǎn)化，并獲得了煙草轉(zhuǎn)化植株。為了探討耐鹽基因 SeNH

2、X1在煙草中的表達(dá)規(guī)律，及其對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽性的影響，本論文研究課題以轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草轉(zhuǎn)化植株為材料，對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，利用RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR對(duì) SeNHX1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)及表達(dá)量進(jìn)行測定，并對(duì)轉(zhuǎn) SeNHX1煙草在鹽脅迫下的生理生化特征進(jìn)行檢測和分析。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　(1)對(duì)轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草 T0代轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行 PCR檢測，結(jié)果顯示 SeNHX1基因成功轉(zhuǎn)入煙草

3、中，初步確定6株轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草植株，分別為S1、S2、S3、S4、S5、S6；分別對(duì)以上轉(zhuǎn)基因煙草植株 T1代進(jìn)行 PCR檢測，結(jié)果初步表明 SeNHX1基因遺傳到轉(zhuǎn)基因煙草 T1代中。
　　(2)分別提取轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的RNA，反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA進(jìn)行 RT-PCR，凝膠電泳出現(xiàn)陽性條帶，表明轉(zhuǎn)基因煙草中 SeNHX1基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)，并進(jìn)一步確定其為轉(zhuǎn)基因植株。
　　(3)利用實(shí)時(shí)熒

4、光定量 PCR對(duì) SeNHX1基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量進(jìn)行測定， SeNHX1基因在非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)基因煙草 S1、S2、S3、S4、S5、S6中的表達(dá)量分別為：0％、20％、26.7％、14.29％、25％、12.5％、23.1％。
　　(4)以 NaCl為鹽脅迫因子，脅迫濃度分別為0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L；檢測非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草在不同鹽脅迫濃度下的抗氧化酶活性、MDA和葉綠

5、素含量的變化，結(jié)果如下：1）非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草的SOD、APX、CAT、POD活性隨鹽濃度的升高而升高，轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草抗氧化酶活性均高于同NaCl脅迫濃度的非轉(zhuǎn)基因煙草。2）在無鹽脅迫的處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量差異不大，在鹽脅迫下，所有煙草 MDA含量隨著 NaCl濃度的升高而升高，所有轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草植株的MDA含量均低于非轉(zhuǎn)基因煙草。3）在鹽脅迫下，轉(zhuǎn) Se

6、NHX1基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠素含量均下降，并且與 NaCl濃度呈負(fù)相關(guān)；在同 NaCl脅迫濃度處理?xiàng)l件下，非轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量低于轉(zhuǎn) SeNHX1煙草，并且隨著 NaCl濃度升高，下降明顯。
　　（5）將轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草的T0代種子和非轉(zhuǎn)基因煙草種子用次氯酸鈉消毒后播種于含0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基上，2周后

7、統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。結(jié)果如下：1）在0 mmol/L NaCl的處理?xiàng)l件下，非轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草種子的發(fā)芽率都接近100％；2）當(dāng)NaCl濃度為50 mmol/L、100 mmol/L時(shí)，所有煙草種子發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)，但非轉(zhuǎn)基因相對(duì)轉(zhuǎn) SeNHX1基因煙草下降幅度稍大；3）當(dāng) NaCl濃度為150 mmol/L時(shí)，所有煙草種子發(fā)芽率大幅度下降，非轉(zhuǎn)基因煙草種子下降顯著；4)當(dāng) NaCl濃度為200 mmol/L時(shí)，所有煙草種子