運(yùn)用RNAi技術(shù)培育抗二化螟水稻.pdf

1、二化螟是水稻的主要害蟲之一，每年由此引發(fā)的水稻減產(chǎn)及抗蟲防治造成大量的經(jīng)濟(jì)損失。目前雖有噴施殺蟲劑以及Bt抗蟲水稻等策略進(jìn)行防治，但二化螟產(chǎn)生抗性和耐受性的周期比較短，不斷探索新的抗蟲策略是長期需要面臨的挑戰(zhàn)。隨著RNA干涉（RNAi）技術(shù)的發(fā)展與成熟，這一技術(shù)也逐漸應(yīng)用于植物抗蟲，并成為抗蟲領(lǐng)域最具潛力的新技術(shù)之一。目前，不少昆蟲被證明可通過轉(zhuǎn)基因植物的方式誘導(dǎo)RNA干涉，為抗蟲植物的培育開辟了一條新途徑。
　　本課題根據(jù)二化螟

2、dsRNA體外喂飼結(jié)果，確定了5個(gè)具有RNA干涉效果的靶基因，分別針對(duì)這5個(gè)靶基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的dsRNA和miRNA表達(dá)載體，并將這些RNA干涉載體分別導(dǎo)入到水稻植株中，對(duì)獲得的RNA干涉植株進(jìn)行抗蟲性鑒定，發(fā)現(xiàn)針對(duì)二化螟VATP酶靶基因進(jìn)行RNA干涉具有抗蟲的效果。經(jīng)過多次獨(dú)立的抗蟲鑒定，證明該RNA干涉效果穩(wěn)定。二化螟幼蟲取食VATP酶基因RNA干涉轉(zhuǎn)基因植株后，表現(xiàn)出平均蟲重和生長速率顯著降低，其中平均蟲重和對(duì)照相比可降低29.4％

3、～50.8％，生長速率對(duì)照相比可降低17.2％～18.1％。并且導(dǎo)致二化螟幼蟲的平均生長周期延長2.3～3.3d。除此之外，RNA干涉效應(yīng)還可以從親本傳遞給子代。即使子代不再取食RNA干涉轉(zhuǎn)基因植株，其平均蟲重的增長依然受到與親本相似的影響，顯示出了二化螟這個(gè)物種的RNA干涉效應(yīng)可傳遞給后代。
　　運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)二化螟六個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的小RNA進(jìn)行了分析及鑒定，通過生物信息學(xué)分析比對(duì)出了大量二化螟保守的小RNA片段，并鑒定出

4、了二化螟特異miRNA(novel miRNA)104條，其中有57條可能在二化螟中腸組織中表達(dá)。對(duì)所有104條novel miRNA進(jìn)行分子生物學(xué)驗(yàn)證，從中篩選出5條中腸表達(dá)的novelmiRNA構(gòu)建人工microRNA表達(dá)載體，導(dǎo)入到水稻中并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗蟲性鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明，5個(gè)novel miRNA干涉片段中的2個(gè)干涉片段對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)二化螟表現(xiàn)出抗蟲效果，且同樣是通過影響二化螟的體重增長和生長速率而最終使得二化

5、螟幼蟲的生長歷期延長。通過昆蟲自身的novel miRNA構(gòu)建RNA干涉載體的策略雖未見報(bào)道，我們的研究證實(shí)這可能是一種構(gòu)建RNA干涉載體的新策略。
　　通過針對(duì)二化螟靶基因和二化螟內(nèi)源小RNA涉及RNA干涉載體兩種不同的二化螟RNA干涉策略，我們發(fā)現(xiàn)miRNA是對(duì)二化螟十分有效的一種RNA干涉方式。雖然在細(xì)胞內(nèi)miRNA的干涉效果對(duì)比dsRNA不具有優(yōu)勢(shì)，但在整體上看表達(dá)人工miRNA的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)二化螟的抗蟲效果要優(yōu)于表達(dá)ds