外源性一氧化氮合酶抑制物對正常大鼠心功能和心肌線粒體功能的影響及其機制.pdf

1、研究背景和目的:隨著經(jīng)濟的快速增長，社會競爭壓力的增加，人們生活水平的提高，以及工作、生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)的發(fā)病率不斷增加，已成為嚴重威脅人類健康的常見疾病。糖尿病易并發(fā)心血管疾病，已成為糖尿病病人致殘、致死的主要原因，尤其是糖尿病心肌病(DiabeticCardiomyopathy， DCM)近年來備受關(guān)注。人們已經(jīng)認識到，糖尿病心肌病是糖尿病病人所特有的并發(fā)癥，不能用高血壓病、

2、冠心病、心瓣膜病以及其他心臟疾病來解釋的獨立性心肌疾病。糖尿病心肌病的主要表現(xiàn)是先出現(xiàn)左心室舒張功能障礙，并左心室順應(yīng)性降低及左心室肥厚，然后發(fā)展為收縮功能受損、左心室擴張，并心律失常和心力衰竭。糖尿病心肌病的主要病理改變是心肌微血管內(nèi)皮細胞損害，內(nèi)膜下纖維增生，血管基底膜增厚，心肌間質(zhì)炎癥和纖維化，心肌細胞肥大、凋亡。然而有關(guān)糖尿病心肌病的發(fā)生機制卻不完全清楚。近年來有文獻報道，線粒體功能障礙與糖尿病心肌病有關(guān)。我室前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿

3、病大鼠血中內(nèi)源性一氧化氮合酶(Nitricoxide synthase，NOS)抑制物非對稱性二甲基精氨酸(Asymmetricdimethylarginine，ADMA)含量明顯升高，不僅與糖尿病內(nèi)皮功能不全和大血管并發(fā)癥密切相關(guān);而且近年來還研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠內(nèi)源性ADMA升高也與心肌線粒體生物合成抑制和線粒體功能障礙有關(guān);但尚未探討糖尿病內(nèi)源性ADMA升高與心功能不全的關(guān)系。NOS抑制物對線粒體功能和心功能的直接作用均尚未見國內(nèi)

4、外文獻報道。因此，本研究擬給正常SD大鼠腹腔注射外源性NOS抑制物NG-硝基-L-精氨酸（NG-nitro-L-arginine，L-NNA），觀察對大鼠心功能和心肌線粒體功能以及線粒體生物合成的影響，并進一步從補充一氧化氮(Nitric oxide，NO)合成前體L-精氨酸（L-Arigine，L-Arg）和選用抗糖尿病藥物二甲雙胍（Metformin，Met）以增加線粒體生物合成的兩個方面來探討L-NNA對大鼠心功能和心肌線粒體功能

5、與線粒體生物合成作用的影響，旨在證明內(nèi)、外源性NOS抑制物對線粒體功能和線粒體生物合成的抑制作用，揭示ADMA在糖尿病心肌病中的重要作用及機制，為闡明糖尿病心肌病的發(fā)病機制提供新的實驗數(shù)據(jù)，并為糖尿病心肌病的臨床防治及藥物研發(fā)提供新的啟示。
　　 方法:(1)動物實驗:采用體重為150～180g的健康雄性SD大鼠，隨機分為6組，①Control，②L-NNA組（30 mg/Kg/d），③L-Arg+L-NNA組(100 mg/K

6、g/d+30 mg/Kg/d),④Met+L-NNA組(125μg/Kg/d+30 mg/Kg/d),⑤L-Arg組(100 mg/Kg/d),⑥Met組（125μg/Kg/d）。第②、⑤和⑥組大鼠每天按提示的劑量腹腔注射相應(yīng)藥物，第③和④組大鼠每天先腹腔注射L-Arg100 mg/Kg或Met125μg/Kg，1h后再腹腔注射L-NNA30 mg/Kg;正常對照組每天腹腔注射等體積的PBS。造模8周后采用M型超聲心動檢測各組大鼠心臟形

7、態(tài)及功能變化;10周后采用頸動脈插管的方法直接檢測各組大鼠頸動脈及左心室血流動力學(xué)指標，并迅速摘取心臟稱重，分離左心室乳頭肌和胸主動脈，分別檢測乳頭肌對電刺激的收縮反應(yīng)和血管環(huán)對乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)等心血管功能變化;用心肌組織中線粒體基因細胞色素氧化酶亞單位Ⅰ(CytochromeoxidaseⅠ，COXⅠ)與核基因β-actin的拷貝數(shù)比值、線粒體生物合成調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因過氧化物酶體增殖物受體γ共激活因子(Peroxisom

8、eproliferation things co-activated factor receptorγ，PGC-1α)的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達水平、線粒體解偶聯(lián)蛋白2(Uncoupling protein，UCP2)mRNA水平和心肌組織中ATP含量檢測以反映模型大鼠心肌線粒體功能變化;用RT-PCR和Western blotting蛋白印跡方法檢測大鼠心肌組織中內(nèi)源性ADMA的主要生成酶蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(Protein argin

9、ine methyltransferase1，PRMT1)、內(nèi)源性ADMA的主要代謝酶二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(Dimethylarginiedimethylaminohydrolase，DDAH)和內(nèi)皮型NOS(Endothelial NOS，eNOS)的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平，以及用比色法檢測心肌組織中NOS活性及NO代謝產(chǎn)物含量等來共同反映心肌組織中PRMT1/DDAH/ADMA/NOS/NO通路的變化;另外還檢測心肌組織中脂質(zhì)過氧

10、化產(chǎn)物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量和抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性以反映氧化應(yīng)激水平。
　　 (2)細胞實驗:分別采用30 mmol/L的葡萄糖(Glucose，Glu)和100μmol/L的游離脂肪酸油酸(Oleinic acid，OA)、30μmol/L ADMA及30μmol/L L-NNA孵育新生SD大鼠乳鼠原代心肌細胞48h后，用線粒體膜電位的熒光

11、探針JC-1檢測心肌細胞線粒體膜電位的變化;用PCR和RT-PCR方法檢測線粒體基因COXⅠ與核基因β-actin的拷貝數(shù)比值、UCP2基因轉(zhuǎn)錄水平;用Western blotting方法檢測PRMT1/DDAH/NOS通路蛋白和PGC-1α蛋白表達變化;并觀察1mmol/L L-Arg和300μ mmol/L Met預(yù)處理后對原代心肌細胞線粒體膜電位和PRMT1/DDAH/NOS通路蛋白表達改變的影響。
　　 結(jié)果:(1)動物

12、實驗結(jié)果:①給正常SD大鼠腹腔注射內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物L(fēng)-NNA8周后，M型超聲檢測揭示心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如左室后壁舒張末期厚度(LVPWd)及室間隔舒張末期厚度(IVSd)增加，左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)及左心室收縮末期內(nèi)徑增加，提示左心室壁肥厚，心臟結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu);此外，反映心臟室間隔收縮幅度的IVSd％和反映左室后壁收縮幅度的LVPW％均明顯降低;左室舒張末容量(EDV)，左心室射血分數(shù)(EF％)，短軸縮短率(FS％)

13、也顯著低于正常對照組大鼠;提示左心室收縮功能降低。②腹腔注射外源性NOS抑制物L(fēng)-NNA的模型大鼠飼養(yǎng)10周后，大鼠心指數(shù)明顯增加;從頸動脈插管至左心室檢測頸動脈血壓顯示，大鼠頸動脈收縮壓和舒張壓、平均動脈壓、平均舒張壓和搏切跡壓力較正常對照組均顯著升高;離體胸主動脈環(huán)對乙酰膽堿(Acetylcholine，ACh)誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低，提示外源性注射L-NNA可強烈收縮血管，抑制血管內(nèi)皮依賴性功能。③外源性腹腔注射NOS抑制物

14、L-NNA模型大鼠心肌COXⅠ/β-actin比值、線粒體生物合成調(diào)節(jié)的關(guān)鍵基因PGC-1α的mRNA和蛋白水平均明顯低于正常對照組大鼠，提示心肌線粒體生物合成抑制;L-NNA模型組大鼠心肌組織ATP含量減少，線粒體解偶聯(lián)蛋白UCP2 mRNA水平較正常組顯著增加，提示L-NNA模型大鼠心肌線粒體功能障礙。④外源性腹腔注射NOS抑制物L(fēng)-NNA模型大鼠心肌組織中PRMT1蛋白表達增加，但mRNA水平降低，DDAH1和DDAH2的蛋白及m

15、RNA水平均降低，eNOS蛋白表達也明顯降低，NO含量顯著減少，提示PRMT1/DDAH/NOS/NO通路異常。⑤外源性腹腔注射NOS抑制物L(fēng)-NNA模型大鼠心肌組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯增高，而抗氧化酶SOD活性卻顯著降低，提示氧化應(yīng)激增加。⑥無論是給予NO的合成前體L-Arg或增加線粒體生物合成的口服降糖藥Met治療10周后，均可不同程度地改善L-NNA對大鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能、血管內(nèi)皮功能、線粒體功能、線粒體生物合成以及PRMT

16、1/DDAH/NOS/NO通路的影響。
　　 (2)細胞實驗結(jié)果:在原代培養(yǎng)的SD新生大鼠心肌細胞，無論是采用高糖、高脂肪酸，還是內(nèi)、外源性NOS抑制物ADMA和L-NNA孵育心肌細胞48h后，均能降低線粒體膜電位，上調(diào)線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)蛋白UCP2基因轉(zhuǎn)錄水平;減低線粒體DNA含量，下調(diào)PGC-1α蛋白表達，提示內(nèi)、外源性NOS抑制物與高糖、高脂肪酸同樣具有抑制線粒體功能和線粒體生物合成的作用。此外，高糖、高脂肪酸和內(nèi)、外

17、源性NOS抑制物亦可上調(diào)原代心肌細胞PRMT1、DDAH和eNOS的蛋白表達，引起原代心肌細胞PRMT1/DDAH/NOS通路異常。分別采用NO合成前體L-Arg和增加線粒體生物合成的Met治療后均可不同程度的改善內(nèi)、外源性NOS抑制物所引起的上述變化。
　　 結(jié)論:1、給正常SD大鼠長期腹腔注射外源性NOS抑制物明顯增加外周動脈壓力，這可能是由于抑制了血管內(nèi)皮依賴性舒張功能所致;
　　 2、長期注射外源性NOS抑制物可