復(fù)方茯苓甘草湯不同煎劑防治大鼠肺動脈高壓的藥效及毒性研究.pdf

1、目的：
　　 通過建立常壓缺氧性肺動脈高壓動物模型,分別以肺動脈高壓、肺血管形態(tài)學(xué)、右心指數(shù)和動脈血?dú)獾母淖優(yōu)橹笜?biāo),將復(fù)方作為一個整體,采用不同的中藥制劑配方組成,將復(fù)方水煎液進(jìn)行動物的藥效學(xué)研究,進(jìn)而確定哪個方案更具臨床療效。然后對該方案進(jìn)行動物毒性實(shí)驗(yàn)研究,探討該復(fù)方的藥物安全性,為進(jìn)一步的研究就是探討中藥的現(xiàn)代化運(yùn)用成分研究,賦予傳統(tǒng)的中醫(yī)方藥以現(xiàn)代的科學(xué)內(nèi)涵,為臨床開發(fā)安全有效、質(zhì)量可控的治療HPH的中藥新藥奠定基礎(chǔ)。<

2、br>　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)分不同中藥制劑水煎液藥效實(shí)驗(yàn)及復(fù)方茯苓甘草湯水煎液對SD大鼠的毒性實(shí)驗(yàn)兩個部分。
　　 1.不同中藥制劑水煎液藥效實(shí)驗(yàn):照薛全福等[62]的方法并略改動。采用SPF級SD系雄性大鼠50只,體量200~220g,隨機(jī)分組分為空白組、對照組、飲片組、免煎組和再煎組,每組10只。大鼠按組別置于缺氧艙內(nèi),控制艙內(nèi)氧濃度在10±0.5％范圍。每天缺氧8小時,連續(xù)缺氧21天?？瞻捉M不缺氧,每天予生理鹽

3、水4ml灌胃,其余各組缺氧前每天予藥液4ml灌胃。21天后行右心導(dǎo)管法檢測大鼠平均肺動脈壓(mPAP),然后處死大鼠,取完整右下肺常規(guī)石蠟包埋切片,行HE及Weigert彈性纖維染色,光鏡下觀察并計(jì)數(shù)肺小血管(15μm＜外徑≤50μm)中肌型動脈(MA)、部分肌型動脈(PMA)和無肌型動脈(NMA)的數(shù)目,分別計(jì)算占肺小血管總數(shù)的百分比。利用圖像分析系統(tǒng)測量肺中小型動脈相對中膜厚度(RMT)及面積(RMA)。并進(jìn)行肺大皰面積比例的計(jì)算,

4、每只大鼠選一相同肺組織橫向切片,每張切片用Leica Qwin圖像分析系統(tǒng)測定肺大皰總面積(SB)、肺組織總面積(SL),計(jì)算肺大皰總面積與肺組織總面積的比值(SB/SL)。計(jì)算右心肥厚指數(shù)[RV/(LV+S)]。心臟采血5ml,裝入抗凝管中,冷藏箱保存,急送檢驗(yàn)進(jìn)行動脈血?dú)夥治?。檢測相關(guān)指標(biāo),采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析:計(jì)量資料用((x)±s)表示,多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析,先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),總體方差齊時用Bonfe

5、rroni法,方差不齊時用Tamhane's T2法,P＜0.05時差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,比較不同中藥組分制劑對防治肺動脈高壓療效結(jié)果。
　　 2復(fù)方茯苓甘草湯水煎液對SD大鼠的毒性實(shí)驗(yàn):
　　 2.1復(fù)方茯苓甘草湯水煎液不同濃度劑量分組:
　　 急性毒性組—因在預(yù)實(shí)驗(yàn)中無法測出LD50,故進(jìn)行了大鼠一天多次灌胃給藥的最大給藥量的測定,結(jié)果最大給藥量600g生藥/kg,相當(dāng)于人用劑量100倍,人用劑量為1g生藥/kg

6、,人體重以60kg計(jì)。
　　 高劑量給藥組—全方藥物按生藥材比例稱量,以360g生藥/kg混懸液,相當(dāng)于人用劑量的60倍,濃縮成6g生藥/ml濃度,罐封冷藏備用。
　　 中劑量給藥組—全方藥物按生藥材比例稱量,以180g生藥/kg混懸液,相當(dāng)于人用劑量的30倍,濃縮成6g生藥/ml濃度,罐封冷藏備用。
　　 低劑量給藥組—全方藥物按生藥材比例稱量,以90g生藥/kg混懸液,相當(dāng)于人用劑量的15倍,濃縮成6g生藥/

7、ml濃度,罐封冷藏備用。
　　 2.2動物篩選與驗(yàn)證SPF級SD系雌雄各半大鼠100只,體重200~220g,隨機(jī)分組分為空白組、急性毒性組、高劑量組、中劑量組和低劑量組,每組20只。空白組不給藥,每天予生理鹽水自由飲用,急性毒性組一天5次灌胃,4ml/次,其余三組每天按濃度限量配水飲用。分別于給藥30天后及停藥14天后隨機(jī)選取一半大鼠處死,完整剪下心臟、肝臟、腎臟、脾、肺、腎臟、子宮、睪丸、卵巢、附睪、腎上腺,冰鹽水洗凈并經(jīng)濾

8、紙吸干后,電子天平稱量重量,計(jì)算臟器指數(shù)[R·(L+S)-1]。各器官取部分組織用福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋切片,行HE及Weigert彈性纖維染色,光鏡下觀察各組織形態(tài)結(jié)構(gòu)是否異常。心臟采血2ml,裝入抗凝管中,冷藏箱保存,急送血液學(xué)檢測。心臟采血3ml,裝入促凝管中,冷藏箱保存,急送生化學(xué)檢測。數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,多組之間比較采用方差分析,以.P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.慢性缺氧21天后,B組大鼠的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(%)、PMA(%)、MA/LA比值比A組的均明顯升高(P＜0.01),而NMA(%)則明顯降低。右心肥厚,肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞破壞,中膜增厚,外膜炎性細(xì)胞浸潤,管壁細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積,管腔狹窄,無肌型及部分肌型動脈肌化,顯示慢性缺氧性肺動脈(PAH)高壓大鼠模型成功建立。
　　 2.經(jīng)治療后C組、D組、E組

10、的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW、MA(%)、PMA(%)、MA/LA比值與B組的比較,均有所下降(P＜0.01),但未能恢復(fù)到A組水平(P＜0.01)。另外,C組、D組、E組之間的mPAP、RV/(LV+S)、wW/BW相比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但三組相比較,C組最高,D組次之,E組最低。C組、D組、這兩組的肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞連續(xù)性破壞,中膜平滑肌細(xì)胞增生、內(nèi)外彈力層距離、管壁ECM沉積及外膜炎性細(xì)胞浸潤均

11、較B組減輕,肺泡間無肌型動脈肌化現(xiàn)象減少,總體改善以C組最明顯。E組的肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞連續(xù)性受破壞程度較B組輕,但較C組、D組稍重,中膜平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)增生肥大,內(nèi)外彈力層距離稍增寬,外膜炎性細(xì)胞浸潤,管壁增厚,管腔狹窄或呈不規(guī)則樣,肺泡間無肌型動脈內(nèi)膜輕度增生肥厚,彈力纖維有增生,并出現(xiàn)平滑肌。
　　 3.可認(rèn)為中藥飲片水煎液和免煎顆粒水溶液在防治常壓缺氧性PAH大鼠無論是在器質(zhì)性和功能性效果無明顯差異,而結(jié)合經(jīng)濟(jì)及便利性方

12、面的考量,在接下來的復(fù)方茯苓甘草湯的毒性實(shí)驗(yàn)里,我們選擇性價比更高的中藥飲片作為實(shí)驗(yàn)藥品。
　　 4.按最大濃度、最大容積給藥,大鼠口服復(fù)方茯苓甘草湯中藥飲片水煎液的MTD為120g/kg:按一天內(nèi)多次最大量給藥,口服復(fù)方茯苓甘草湯中藥飲片水煎液的MTD為600g/kg。給藥1天后,20只大鼠神疲乏力,少氣懶動,扎堆取暖,大便稀溏未見小鼠口、鼻、眼有異常分泌物出現(xiàn)。第14天,20只大鼠與別組大鼠狀況無明顯差異,一般狀況良好,活動

13、、食量正常,無死亡情況。
　　 5.大鼠連續(xù)給藥復(fù)方茯苓甘草湯30d后,Ⅲ組白細(xì)胞計(jì)數(shù)與Ⅰ組相比有差異性(0.01＜P＜0.05),Ⅳ組、Ⅴ組兩個劑量組的AST值升高,與Ⅰ組相比具有差異性高(P＜0.01),停藥后1天,將受試動物隨機(jī)選取一半處死,取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸等經(jīng)肉眼觀察,外觀、形態(tài)、大小及顏色均正常,未發(fā)現(xiàn)充血、腫脹及壞死等異常現(xiàn)象;給藥組動物的臟器系數(shù)與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05),將上述組織器官經(jīng)

14、病理組織學(xué)檢查,亦未見組織萎縮、增生、炎細(xì)胞浸潤及細(xì)胞退行性變等明顯病理變化及與中毒有關(guān)的病理性改變。
　　 6.停藥14d后,大鼠攝食量、體重、行為活動、血象和重要器官臟器系數(shù)均正常;病理學(xué)檢查,各組各臟器均未發(fā)現(xiàn)明顯變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.復(fù)方茯苓甘草湯的中藥飲片水煎液、免煎顆粒水溶液、免煎顆粒再煎液對防治常壓缺氧性PAH大鼠模型都是有效的。而三者相比較起來,中藥飲片水煎液、免煎顆粒水溶液的效果較免煎

15、顆粒再煎液更為明確。
　　 2.復(fù)方茯苓甘草湯中各成分的中藥飲片及免煎顆粒的療效無明顯差異性,這六種中藥的飲片制劑及免煎制劑的一次煎煮效果接近,而免煎顆粒在水溶解后再煎煮對肺動脈高壓的療效略遜于首次溶解。
　　 3.復(fù)方茯苓甘草湯可采用免煎顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的中藥飲片。
　　 4.按最大濃度、最大容積給藥,大鼠口服復(fù)方茯苓甘草湯中藥飲片水煎液的MTD為120g/kg:按一天內(nèi)多次最大量給藥,口服復(fù)方茯苓甘草湯中藥飲片水

16、煎液的MTD為600g/kg。
　　 5.大鼠連續(xù)給藥30d后,Ⅲ組白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高為過量用藥后反應(yīng)的一過性升高。Ⅴ組的AST顯著升高原因?yàn)樾呐K取血時人為因素地產(chǎn)生額外手術(shù)創(chuàng)傷,因AST的敏感性較ALT高。而Ⅳ組前后AST升高無顯著差異性,但ALT與Ⅰ組無明顯差異性(P＞0.05)。給藥組動物的臟器系數(shù)與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05),提示復(fù)方茯苓甘草湯長期給藥對動物主要器官的生長發(fā)育無明顯影響。
　　 6.停藥1