新型PPARγ激動(dòng)劑DH9抑制多囊腎囊腫襯里上皮細(xì)胞增殖的作用和機(jī)制研究.pdf

1、本研究由三部分組成： 一、β-catenin在ADPKD腎組織中的表達(dá)及分布 采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)觀察β-catenin在人及ADPKD動(dòng)物模型PKDV/V小鼠多囊腎組織中及相應(yīng)正常腎組織中的定位；蛋白免疫印跡法檢測(cè)β-catenin在正常腎組織和多囊腎組織中的表達(dá)。本部分旨在觀察β-catenin在多囊腎組織及正常腎組織中的表達(dá)分布差異，并初步探討β-catenin在多囊腎病發(fā)病中促進(jìn)其增殖的作用機(jī)制。結(jié)果顯示：在

2、人正常腎組織中，β-catenin主要分布在腎小管上皮細(xì)胞的胞膜上，胞漿及胞核未見(jiàn)明顯的棕黃色染色；而在人ADPKD腎組織的非囊腫腎組織中，我們發(fā)現(xiàn)雖然小管結(jié)構(gòu)尚可，但β-catenin已經(jīng)失去正常的胞膜分布，異位至胞漿中，但胞核內(nèi)少見(jiàn)；而在人ADPKD多囊腎組織中，正常腎小管形態(tài)消失，被大小不等的囊泡取代，β-catenin在胞漿中表達(dá)明顯增多，并且異位至胞核中。在PKDv/v小鼠中，β-catenin異位至胞核，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，明顯高

3、于野生型C57BL/6小鼠。Westernblot技術(shù)檢測(cè)到人的多囊腎組織β-catenin蛋白表達(dá)高于正常腎組織(P＜0.05)；PKDv/v小鼠的腎組織比同周齡的野生型C57BL/6小鼠β-catenin蛋白表達(dá)明顯增多(P＜0.01)。以上結(jié)果證實(shí)作為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路“分子開(kāi)關(guān)”β-catenin在多囊腎組織中的定位存在胞膜-胞漿-胞核的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，并且其表達(dá)明顯升高，說(shuō)明了在人的多囊腎發(fā)病過(guò)程中，β-cat

4、enin與囊腫襯里上皮細(xì)胞的高度增殖和細(xì)胞間黏附力減弱、細(xì)胞極性倒置密切相關(guān)。 二、新型PPARγ激動(dòng)劑(DH9)對(duì)人囊腫襯里上皮細(xì)胞(WT9-12)增殖抑制的研究 采用不同濃度的DH9藥物作用WT9-12細(xì)胞24、48、72、96h，并與羅格列酮做比較，噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；做如下實(shí)驗(yàn)分組：DH9藥物單作用組、蛋白酶體抑制劑MG132+DH9共處理組、GSK3β抑制劑SB216763+DH9共處理組、PP

5、ARγ抑制劑GW9662+DH9共處理組分別干預(yù)WT9-12細(xì)胞72小時(shí)后，收集細(xì)胞裂解總蛋白，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠璧鞍酌庖哂≯E技術(shù)分別檢測(cè)β-catenin、磷酸化β-catenin、GSK3β、磷酸化GSK3β的蛋白水平；RT-PCR方法測(cè)定β-cateninmRNA水平。此部分實(shí)驗(yàn)旨在比較噻唑烷二酮類(lèi)的PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮及羧酸類(lèi)新型PPARγ激動(dòng)劑DH9藥物對(duì)WT9-12細(xì)胞增殖抑制作用的差異，并研究DH9對(duì)WT9-12的增殖抑

6、制作用與經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)系，并初步探討DH9藥物影響β-catenin可能的機(jī)制。結(jié)果顯示：不同濃度羅格列酮干預(yù)WT9-12細(xì)胞起效時(shí)間長(zhǎng)，所需濃度高，在72小時(shí)后才顯著發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)，與羅格列酮相比，DH9藥物24小時(shí)即可起效，48小時(shí)可有明顯的增殖抑制效應(yīng)。相同濃度的DH9及羅格列酮干預(yù)72小時(shí)發(fā)現(xiàn)DH9的增殖抑制作用明顯優(yōu)于羅格列酮(P＜0.01)，在加入GW9662預(yù)處理2小時(shí)后，再分別予D

7、H9和羅格列酮共處理72小時(shí)，發(fā)現(xiàn)加入GW9662前后均不能阻斷DH9和羅格列酮的抗增殖效應(yīng)。DH9可減少WT9-12細(xì)胞β-catenin的蛋白表達(dá)，其抑制作用具有時(shí)間依賴性；給予DH9藥物濃度越大，細(xì)胞β-catenin的蛋白表達(dá)量逐漸減低，失活形式的磷酸化β-catenin表達(dá)增多，顯示DH9對(duì)β-catenin的作用具有明顯的劑量依賴性；但DH9對(duì)WT9-12細(xì)胞β-catenin mRNA水平無(wú)明顯變化。DH9對(duì)活性形式的GS

8、K3β無(wú)明顯改變，但可以上調(diào)其磷酸化GSK3β的蛋白表達(dá)；在給予MG132或者SB216763預(yù)處理后與DH9共處理72小時(shí)，可逆轉(zhuǎn)DH9對(duì)β-catenin的下調(diào)作用，但GW9662無(wú)此作用。綜合以上結(jié)果說(shuō)明DH9較羅格列酮可顯著抑制WT9-12細(xì)胞增殖，這種增殖抑制作用可通過(guò)蛋白酶體的作用以及GSK3β依賴的方式下調(diào)β-catenin的蛋白表達(dá)從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，與PPARγ途徑無(wú)關(guān)。 三、新型P

9、PARγ激動(dòng)劑(DH9)對(duì)囊腫襯里上皮細(xì)胞周期及凋亡的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DH9藥物作用72小時(shí)觀察細(xì)胞周期的改變，蛋白免疫印跡分析DH9藥物對(duì)P21CIP/WAF1和cyclinA蛋白表達(dá)的影響；AnnexinV+PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞的凋亡率，Western blot方法分析Bcl-2及Bax表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察DH9對(duì)WT9-12細(xì)胞增殖的抑制與細(xì)胞周期和凋亡的關(guān)系，并初步探討其作用機(jī)制。結(jié)果顯示：DH9作用72

10、小時(shí)能夠阻止WT9-12細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，表現(xiàn)為誘導(dǎo)S期停滯，減少進(jìn)入G2/M期的細(xì)胞數(shù)量；隨DH9干預(yù)濃度的升高P21CIP/WAF1蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)而cyclinA的表達(dá)逐漸減弱。AnnexinV+PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DH9可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。40、60、80μM DH9作用WT9-12細(xì)胞72小時(shí)后，凋亡率分別為4.28±0.29％，10.83±0.58％和18.72±0.46％，顯著高于對(duì)照組3.69±0.25％，Wes

11、tern blot結(jié)果顯示Bcl-2的蛋白表達(dá)量逐漸減少，而B(niǎo)ax的表達(dá)量逐漸增多。本部分實(shí)驗(yàn)得出：DH9能夠通過(guò)阻斷WT9-12細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程，表現(xiàn)為S期阻滯；通過(guò)下調(diào)Bcl-2/Bax比值誘導(dǎo)凋亡從而抑制WT9-12細(xì)胞增殖。 綜合三部分結(jié)果，我們得出結(jié)論：β-catenin在ADPKD腎組織中存在異常分布及表達(dá)；DH9可通過(guò)下調(diào)β-catenin的表達(dá)影響Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、阻斷細(xì)胞S期進(jìn)程、誘導(dǎo)凋亡