腸道動力分子調(diào)控機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景
　　 腸道動力異常被認(rèn)為在諸多功能性胃腸病的發(fā)病中起重要作用，但腸動力異常的發(fā)病機(jī)制始終未明確。
　　 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，與其特異性蛋白酪氨酸激酶受體B(tyrosinekinasereceptorB，TrkB)結(jié)合后，激活磷脂酶C(phospholipaseC，PLC)/三磷酸肌醇(inositoltriph

2、osphate，IP3)信號傳導(dǎo)途徑，使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高，增強(qiáng)神經(jīng)肌肉接頭突觸興奮性神經(jīng)傳導(dǎo)。近年研究發(fā)現(xiàn)BDNF和TrkB受體在腸道高表達(dá)。幾項(xiàng)臨床和動物研究表明BDNF可以加快成人的腸道排空及增強(qiáng)大鼠腸道平滑肌的肌電活動，提示BDNF可能通過TrkB-PLC/IP3信號通路發(fā)揮著重要的促進(jìn)腸動力作用。
　　 近來有研究發(fā)現(xiàn)BDNF與P物質(zhì)(substanceP,SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-r

3、elatedpeptide，CGRP)等神經(jīng)遞質(zhì)在中樞或外周神經(jīng)突觸囊泡內(nèi)共儲存，并可以促進(jìn)這些神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，增強(qiáng)其功能，表明BDNF可能作為一種神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)通過調(diào)節(jié)SP、CGRP等其他神經(jīng)遞質(zhì)對腸道的作用，來發(fā)揮其對腸動力的調(diào)節(jié)作用。
　　 目的
　　 本研究采用在體和離體方法監(jiān)測小鼠腸道運(yùn)動，探討B(tài)DNF對小鼠在體及離體腸道動力的具體作用及機(jī)制，明確SP和CGRP對小鼠離體腸道動力的影響，研究BDNF對SP和CG

4、RP引起的小鼠離體腸道收縮活動的調(diào)節(jié)作用，探究小鼠腸道動力的分子調(diào)控機(jī)制。
　　 方法
　　 實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性C57B1/6(BDNF+/+)小鼠和BDNF基因敲除(BDNF+/-)小鼠。
　　 1:在體腸動力檢測:兩組小鼠行1小時(shí)糞粒計(jì)數(shù)和24小時(shí)糞便含水量檢測及碳末推進(jìn)檢測
　　 2離體腸動力檢測:制備BDNF+/+小鼠和BDNF+/-小鼠腸道離體縱行肌條，在灌流肌槽中孵育，并記錄肌條的收縮活動。

5、以平滑肌肌條張力變化為指標(biāo)，觀察不同干預(yù)對腸道肌條收縮活動的影響。
　　 2.1觀察不同濃度的BDNF、SP和CGRP對BDNF+/+小鼠肌條收縮活動的影響。
　　 2.2觀察TrkB受體抗體、新霉素（PLC阻滯劑）和肝素（IP3阻滯劑）孵育肌條后，對BDNF引起的肌條收縮活動的影響。
　　 2.3觀察外源性BDNF孵育肌條后，對SP和CGRP引起的肌條收縮活動的影響。
　　 2.5觀察內(nèi)源性BDNF的減

6、少（BDNF+/-小鼠）和活性的降低（TrkB受體抗體孵育肌條）對SP和CGRP引起的肌條收縮活動的影響。
　　 3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測BDNF+/+小鼠腸道肌條、BDNF+/-小鼠腸道肌條和TrkB抗體孵育的BDNF+/+小鼠腸道肌條BDNF的釋放量。
　　 4免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測TrkB受體在小鼠腸道的分布。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，并采

7、用單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1BDNF+/-小鼠每小時(shí)排便糞粒數(shù)較BDNF+/+小鼠明顯減少，24小時(shí)糞便含水量顯著低于BDNF+/+小鼠。
　　 2BDNF+/-小鼠活性炭黑便排出所需的時(shí)間較BDNF+/+小鼠明顯延長，腸道碳末推進(jìn)率較BDNF+/+小鼠顯著降低。
　　 3BDNF可以明顯增強(qiáng)小鼠回腸、近端結(jié)腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸肌條的收縮活動。

8、>　　 4TrkB受體抗體、新霉素和肝素可明顯減弱BDNF引起的小鼠腸道肌條的收縮。
　　 5SP(1×10-8-1×10-6mol/L)呈濃度依賴性的增強(qiáng)BDNF+/+小鼠腸道肌條的收縮活動。CGRP(1×10-8-1×10-7mol/L)對BDNF+/+小鼠腸道肌條的收縮活動呈先短暫抑制后興奮的效應(yīng)。高濃度CGRP(1×10-6mol/L)可明顯抑制BDNF+/+小鼠肌條的收縮活動。
　　 6外源性BDNF(1×1

9、0-8mol/L)可明顯增強(qiáng)SP及CGRP對小鼠腸道肌條收縮的興奮效應(yīng)。
　　 7與BDNF+/+小鼠相比，SP及CGRP對BDNF+/-小鼠肌條收縮的興奮效應(yīng)明顯減弱。TrkB抗體(1×10-8mol/L)可明顯減弱SP和CGRP對肌條收縮的興奮效應(yīng)。
　　 8BDNF+/-小鼠回腸和遠(yuǎn)端結(jié)腸肌條BDNF的釋放水平明顯降低，大約為BDNF+/+小鼠BDNF釋放水平的一半。與未干預(yù)的BDNF+/+小鼠腸道肌條相比，Trk

10、B抗體孵育的BDNF+/+小鼠肌條BDNF的釋放水平無明顯變化。
　　 9TrkB受體主要分布在小鼠腸道肌間神經(jīng)叢內(nèi)，平滑肌細(xì)胞未見表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1BDNF可增強(qiáng)小鼠在體與離體腸道動力，此增強(qiáng)作用是通過作用于腸神經(jīng)叢TrkB-PLC/IP3信號傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　 2SP呈濃度依賴性的增強(qiáng)小鼠腸道離體肌條的收縮活性，CGRP小鼠腸道肌條的收縮活動呈先短暫抑制后興奮效應(yīng)。
　　 3內(nèi)、