異氟醚暴露后大鼠皮層microRNAs表達變化.pdf

1、目的：
　　1、本研究通過大鼠異氟醚麻醉模型，利用高通量microRNA芯片技術(shù)檢測不同濃度異氟醚暴露后大鼠皮層中microRNAs表達譜變化，并對其進行生物信息學(xué)分析。
　　2、通過熒光素酶報告法在細胞水平對具有顯著性差異表達的microRNAs所預(yù)測的靶基因進行驗證。
　　方法：
　　1、大鼠異氟醚麻醉模型的建立及檢測不同濃度異氟醚暴露后大鼠皮層中microRNAs表達譜變化：雄性SD大鼠12只，體重250±

2、10g，隨機分為對照組（Sham）、2.0％異氟醚吸入組（P1組）、1.5%異氟醚吸入組（P2組）、0.75%異氟醚吸入組（P3組），各實驗組均麻醉維持4h。麻醉結(jié)束后24h取大鼠大腦皮層組織，提取總RNA，通過高通量microRNA芯片技術(shù)檢測各組microRNA表達譜，篩選出顯著差異表達的microRNAs，并通過RT-qPCR驗證結(jié)果。利用GO-Analysis進行生物信息學(xué)分析，統(tǒng)計采用χ2檢驗和fisher檢驗的原理，計算得到

3、p值與p(k)值，后多重比較，得出GO-Analysis的誤判率（FDR），根據(jù)FDR值判斷差異是否具有顯著性；Pathway-Analysis是應(yīng)用fisher精確檢驗和χ2檢驗對microRNAs可能參與的所有Pathway進行分析。
　　2、熒光素酶報告法檢測rno-let-7d可以調(diào)控靶基因PIK3IP1：rno-let-7d為異氟醚暴露后大鼠皮層表達發(fā)生變化的miRNA之一，利用 targetscan軟件預(yù)測到rno-l

4、et-7d可能參與調(diào)控靶基因PIK3IP1，通過PIK3IP13’UTR預(yù)測靶點構(gòu)入熒光素酶報告質(zhì)粒，利用rno-let-7d mimics及陰性對照microRNA-NC分別和PIK3IP1野生型靶標共轉(zhuǎn)做雙熒光檢測，轉(zhuǎn)染48h后觀察細胞狀態(tài)并拍照，并裂解細胞，測試luciferase活性。
　　結(jié)果：MicroRNA芯片檢測結(jié)果顯示在不同濃度異氟醚暴露后中大鼠皮層共有29個microRNAs發(fā)生了表達變化具有顯著性：其中在2.

5、0%異氟醚吸入組（P1組）中19個，1.5%異氟醚吸入組（P2組）13個，0.75%異氟醚吸入組（P3組）4個（三組部分重疊）。通過隨機挑選的部分表達差異具有顯著性miRNAs進行RT-PCR檢測證明microRNA芯片結(jié)果是真實有效。這些microRNAs參與調(diào)控以下信號通路如Metabolic pathways（代謝途徑）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、T細胞受體信號傳導(dǎo)途徑（T cell rec

6、eptor signaling pathway）、PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑（PI3K-Akt signaling pathway）、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路（Neurotrophin signaling pathway）等。let-7d為異氟醚暴露后大鼠皮層表達發(fā)生變化的microRNA之一，通過 let-7d mimics表達后測試luciferase活性發(fā)現(xiàn)，其對PIK3IP13’UTR有抑制作用，從而證實PIK3IP1是let-7