銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵抑制劑篩選模型的構(gòu)建以及反義RNA、正向互補(bǔ)RNA對(duì)MexAB-OprM外排泵表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、細(xì)菌的耐藥性問題日益嚴(yán)峻，尤其是多重耐藥菌的增多，以至抗細(xì)菌感染的治療變得愈加困難，原本具有良好抗菌活性的藥物失去了應(yīng)有的療效。 細(xì)菌可以通過多種途徑來產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐藥性，其中很重要的一條途徑就是通過外排泵將胞內(nèi)抗生素排出，降低胞內(nèi)抗生素的濃度，減弱其作用。細(xì)菌外排泵的作用，除了可直接降低抗生素胞內(nèi)濃度以保護(hù)細(xì)菌外，還能提高細(xì)菌耐藥突變率。因此，尋找外排泵抑制劑，一方面可以解決由于外排泵產(chǎn)生的細(xì)菌耐藥問題，另一方面還可以降低細(xì)

2、菌耐藥突變的發(fā)生率，對(duì)于抗細(xì)菌感染的治療具有重要意義。 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是臨床上常見的一種院內(nèi)感染條件致病菌，其耐藥性機(jī)理十分復(fù)雜，但是對(duì)于多種抗生素高度耐藥，主要是由于兩種機(jī)制的存在：一種是通透性很低的外膜可以阻止抗生素進(jìn)入胞內(nèi)；而另一種機(jī)制則是存在可以主動(dòng)外排多種抗生素的多重耐藥外排泵。 在銅綠假單胞菌中，主要存在7種RND型外排泵，而在這些外排泵中，只有MexAB—Opr

3、M外排泵既為組成性表達(dá)，又能顯著影響耐藥性，因此是銅綠假單胞菌最主要的外排泵，也是通過提高細(xì)菌對(duì)抗生素敏感性以進(jìn)行抗細(xì)菌感染治療的理想靶點(diǎn)。 在本課題中，對(duì)于外排泵抑制劑的研究采用了兩條設(shè)計(jì)路線： 第一條路線是建立MexAB—OprM外排泵抑制劑高通量篩選模型，篩選具有外排泵抑制劑活性的化合物和天然產(chǎn)物。本研究通過在多種外排泵缺陷的銅綠假單胞菌變株N150中克隆表達(dá)MexAB—OprM外排泵的方法構(gòu)建了模式菌株，并通過抗

4、生素敏感性檢測(cè)、mexAB—oprM轉(zhuǎn)錄的分子水平驗(yàn)證以及對(duì)已知外排泵抑制劑的敏感性檢測(cè)等方面對(duì)該模式菌株進(jìn)行評(píng)價(jià)。利用該模式菌株構(gòu)建了銅綠假單胞菌MexAB—OprM外排泵抑制劑篩選模型，并對(duì)化合物與微生物來源的天然產(chǎn)物進(jìn)行了篩選。 第二條路線是嘗試?yán)肦NA技術(shù)，為尋找可以使外排泵相關(guān)基因發(fā)生沉默寡核苷酸藥物奠定基礎(chǔ)。 反義RNA藥物的優(yōu)點(diǎn)是具有靶點(diǎn)特異性，可以特異地抑制靶基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療。因此目前針

5、對(duì)微生物感染和腫瘤等疾病的反義寡核苷酸藥物的研究已有大量報(bào)道。本研究針對(duì)mexAB—oprM操縱子設(shè)計(jì)了一系列的反義RNA，并構(gòu)建了反義RNA表達(dá)載體，在相應(yīng)的銅綠假單胞菌菌株K335和K854中表達(dá)反義RNA。通過反義RNA表達(dá)株對(duì)鹽酸環(huán)丙沙星敏感性的檢驗(yàn)得到了不同反義RNA的作用效果，發(fā)現(xiàn)mexR和mexA基因被反義RNA沉默后能明顯影響MexAB—OprM外排泵的作用，并了解到基因上游區(qū)域以及互補(bǔ)區(qū)域長(zhǎng)度對(duì)于反義RNA在銅綠假單胞

6、菌中發(fā)揮作用的重要性。摸索反義RNA的作用特點(diǎn)為反義寡核苷酸類外排泵抑制劑的研究奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本論文還對(duì)正向互補(bǔ)RNA誘導(dǎo)銅綠假單胞菌mexA基因特異性沉默進(jìn)行探索性研究。俄國(guó)學(xué)者首先在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了正向互補(bǔ)RNA誘導(dǎo)基因特異性沉默的作用，并通過序列分析提出正向互補(bǔ)RNA參與基因調(diào)控的機(jī)制可能廣泛存在于原核生物中。如果在其他原核生物中也發(fā)現(xiàn)平行互補(bǔ)RNA誘導(dǎo)基因特異性沉默現(xiàn)象，那么，可以借鑒反義寡核苷酸藥物的研究策略，

7、開展正向互補(bǔ)寡核苷酸藥物的研究，這將對(duì)抗細(xì)菌藥物的研發(fā)提供新的思路。 在銅綠假單胞菌中，選擇銅綠假單胞菌mexA基因作為目的基因進(jìn)行正向互補(bǔ)RNA誘導(dǎo)基因沉默的研究。通過人工設(shè)計(jì)合成了表達(dá)mexA正向互補(bǔ)RNA的DNA片段。構(gòu)建了正向互補(bǔ)RNA表達(dá)載體，在銅綠假單胞菌菌株K854中表達(dá)正向互補(bǔ)RNA。通過藥物敏感性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于正向互補(bǔ)RNA表達(dá)株，數(shù)種MexAB—OprM底物抗生素的MIC均降低了1/2。通過EB轉(zhuǎn)移檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)