缺氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)的ROCK通路活化在缺氧后血管內(nèi)皮高通透性發(fā)生中的作用.pdf

1、一、背景與目的
　　 燒傷早期因多種因素引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白及細(xì)胞間連接等發(fā)生改變,細(xì)胞間隙增大,通透性增加,大量血漿樣液體從血管滲出,血容量銳減及發(fā)生休克。血管通透性增加是燒傷休克的關(guān)鍵原因,而休克所導(dǎo)致的組織缺血缺氧又加重血管通透性的增加,形成惡性循環(huán)。迄今為止,燒傷早期血管通透性增加的發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚,臨床上則更無有效的治療措施來降低燒傷早期血管通透性的增加。
　　 內(nèi)皮細(xì)胞收縮性改變是不

2、同原因引起血管通透性增加的主要共同通路,而內(nèi)皮細(xì)胞收縮性的調(diào)控主要受細(xì)胞骨架蛋白中肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的影響,并依賴于肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)的磷酸化。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chainkinase,MLCK)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)在MLC磷酸化的調(diào)控中起著極其重要的作用。MLCK受Ca2+-鈣調(diào)蛋白激活后,直接

3、催化MLC從非磷酸化型向磷酸化型轉(zhuǎn)變,使磷酸化型MLC增加;MLCP則催化MLC從磷酸化型向非磷酸化型轉(zhuǎn)變,導(dǎo)致磷酸化型MLC減少,而MLCP活性又受Rho激酶(ROCK)的負(fù)性調(diào)控,故ROCK被激活也引起MIC磷酸化增加。磷酸化的MLC活化肌球蛋白重鏈頭部的ATP酶,產(chǎn)生的能量使細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白微絲滑動(dòng),細(xì)胞發(fā)生收縮,細(xì)胞間隙形成,通透性增加。
　　 缺血缺氧是嚴(yán)重?zé)齻缙谥匾牟±砩碜兓?也是嚴(yán)重?zé)齻缙诙喾N因素造成組織細(xì)

4、胞損害的主要途徑,但缺血缺氧引起嚴(yán)重?zé)齻缙谘芡ㄍ感栽黾拥臋C(jī)制仍未完全闡明。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)被認(rèn)為是介導(dǎo)機(jī)體缺氧反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一,在缺血缺氧的病理生理變化調(diào)控中具有重要作用。目前的一些零星研究表明,HIF-1α參與了血管通透性的調(diào)控,但報(bào)道的分子機(jī)制不完全相同。因此,本課題建立體外單層內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧模型,研究HIF-1α是否通過ROCK-MLC磷酸化通路參

5、與缺氧內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加發(fā)生機(jī)制,以進(jìn)一步闡明燒傷早期缺血缺氧時(shí)血管通透性增加的分子機(jī)制。
　　 一、材料與方法
　　 1.以體外培養(yǎng)的單層血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型,研究缺氧(1％O2)條件下單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化,同時(shí)研究HIF-1α蛋白表達(dá)、緊密連接蛋白o(hù)ccludin蛋白表達(dá)、ROCK通路主要相關(guān)蛋白如RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達(dá)、MLCP亞基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化的變化。
　　 2.研究

6、應(yīng)用ROCK特異性抑制劑ROCKOUT抑制ROCK通路對(duì)缺氧單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性及MLC磷酸化的影響。
　　 3.研究常養(yǎng)條件下應(yīng)用DMOG誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞occludin蛋白表達(dá)及ROCK-MLC磷酸化通路的影響。
　　 4.研究應(yīng)用HIF-1α抑制劑YC-1和寡霉素抑制HIF-1α蛋白表達(dá)后,缺氧內(nèi)皮細(xì)胞ROCK-MIC磷酸化通路活化及單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的變化。
　　 5.構(gòu)建人HIF-1α的

7、RNA干擾表達(dá)載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-siHIF-1α,轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,建立HIF-1α低表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞系,研究抑制HIF-1α基因表達(dá)后缺氧內(nèi)皮細(xì)胞ROCK-MLC磷酸化通路活化以及通透性的變化。
　　 二、主要結(jié)果
　　 1.缺氧后單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性明顯增加,同時(shí)伴隨有ROCK通路的相關(guān)變化,如RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達(dá)增加,MLCP亞基MYPT1磷酸化增加,以及MLC磷酸化增加。

8、
　　 2.缺氧后內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增加。
　　 3.缺氧前后內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin的蛋白表達(dá)無明顯變化。
　　 4.ROCK特異性抑制劑ROCKOUT在明顯抑制缺氧內(nèi)皮細(xì)胞MLC磷酸化的同時(shí),還能部分抑制缺氧引起的單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。
　　 5.常氧條件下HIF-1α誘導(dǎo)劑DMOG不僅明顯誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)增加,還引起ROCKⅡ蛋白表達(dá)、MLCP亞基MYPT

9、1磷酸化以及MLC磷酸化的明顯增加,但對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin的蛋白表達(dá)無明顯影響。
　　 6.HIF-1α抑制劑YC-1和寡霉素明顯抑制缺氧內(nèi)皮細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá),同時(shí)能抑制缺氧引起的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達(dá)增加,MLCP亞基MYPT1磷酸化增加以及MLC磷酸化增加,還對(duì)缺氧后單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加也有部分抑制作用;但對(duì)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞TJ蛋白o(hù)ccludin的蛋白表達(dá)無明顯影響。
　　

10、 7.成功構(gòu)建了HIF-1αRNA干擾表達(dá)載體并穩(wěn)定表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞;抑制HIF-1α基因表達(dá)后,缺氧所引起的內(nèi)皮細(xì)胞RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達(dá)、ROCK激酶活性增加受到抑制,MLCP亞基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化也受到抑制;缺氧單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加也被明顯抑制。
　　 三、結(jié)論
　　 1.缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加伴有ROCK-MLC磷酸化通路的活化,特異性抑制ROCK活性能明顯抑制MLC磷酸化

11、及通透性增加。ROCK通路活化所引起的MLC磷酸化參與了缺氧時(shí)血管內(nèi)皮通透性增加的發(fā)生。
　　 2.ROCK-MLC磷酸化通路活化所引起缺氧內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加伴有HIF-1α蛋白表達(dá)增加,而常氧下誘導(dǎo)HIF-1α蛋白表達(dá)能引起ROCK-MLC磷酸化通路活化,HIF-1α可能在缺氧內(nèi)皮細(xì)胞ROCK-MLC磷酸化通路活化中具有一定作用。
　　 3.HIF-1α的化學(xué)性抑制劑能明顯抑制缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞ROCK-MLC磷酸化通