缺氧誘導因子-1α介導的ROCK通路活化在缺氧后血管內皮高通透性發(fā)生中的作用.pdf

1、一、背景與目的
　　 燒傷早期因多種因素引起血管內皮細胞損傷,導致細胞骨架肌動蛋白及細胞間連接等發(fā)生改變,細胞間隙增大,通透性增加,大量血漿樣液體從血管滲出,血容量銳減及發(fā)生休克。血管通透性增加是燒傷休克的關鍵原因,而休克所導致的組織缺血缺氧又加重血管通透性的增加,形成惡性循環(huán)。迄今為止,燒傷早期血管通透性增加的發(fā)生機制仍不完全清楚,臨床上則更無有效的治療措施來降低燒傷早期血管通透性的增加。
　　 內皮細胞收縮性改變是不

2、同原因引起血管通透性增加的主要共同通路,而內皮細胞收縮性的調控主要受細胞骨架蛋白中肌球蛋白和肌動蛋白的影響,并依賴于肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC)的磷酸化。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chainkinase,MLCK)和肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)在MLC磷酸化的調控中起著極其重要的作用。MLCK受Ca2+-鈣調蛋白激活后,直接

3、催化MLC從非磷酸化型向磷酸化型轉變,使磷酸化型MLC增加;MLCP則催化MLC從磷酸化型向非磷酸化型轉變,導致磷酸化型MLC減少,而MLCP活性又受Rho激酶(ROCK)的負性調控,故ROCK被激活也引起MIC磷酸化增加。磷酸化的MLC活化肌球蛋白重鏈頭部的ATP酶,產生的能量使細胞骨架肌動蛋白微絲滑動,細胞發(fā)生收縮,細胞間隙形成,通透性增加。
　　 缺血缺氧是嚴重燒傷早期重要的病理生理變化,也是嚴重燒傷早期多種因素造成組織細

4、胞損害的主要途徑,但缺血缺氧引起嚴重燒傷早期血管通透性增加的機制仍未完全闡明。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)被認為是介導機體缺氧反應的重要轉錄因子之一,在缺血缺氧的病理生理變化調控中具有重要作用。目前的一些零星研究表明,HIF-1α參與了血管通透性的調控,但報道的分子機制不完全相同。因此,本課題建立體外單層內皮細胞的缺氧模型,研究HIF-1α是否通過ROCK-MLC磷酸化通路參

5、與缺氧內皮細胞通透性增加發(fā)生機制,以進一步闡明燒傷早期缺血缺氧時血管通透性增加的分子機制。
　　 一、材料與方法
　　 1.以體外培養(yǎng)的單層血管內皮細胞為模型,研究缺氧(1％O2)條件下單層內皮細胞通透性的變化,同時研究HIF-1α蛋白表達、緊密連接蛋白occludin蛋白表達、ROCK通路主要相關蛋白如RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達、MLCP亞基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化的變化。
　　 2.研究

6、應用ROCK特異性抑制劑ROCKOUT抑制ROCK通路對缺氧單層內皮細胞通透性及MLC磷酸化的影響。
　　 3.研究常養(yǎng)條件下應用DMOG誘導HIF-1α蛋白表達對內皮細胞occludin蛋白表達及ROCK-MLC磷酸化通路的影響。
　　 4.研究應用HIF-1α抑制劑YC-1和寡霉素抑制HIF-1α蛋白表達后,缺氧內皮細胞ROCK-MIC磷酸化通路活化及單層內皮細胞通透性的變化。
　　 5.構建人HIF-1α的

7、RNA干擾表達載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-siHIF-1α,轉染內皮細胞,建立HIF-1α低表達內皮細胞系,研究抑制HIF-1α基因表達后缺氧內皮細胞ROCK-MLC磷酸化通路活化以及通透性的變化。
　　 二、主要結果
　　 1.缺氧后單層內皮細胞的通透性明顯增加,同時伴隨有ROCK通路的相關變化,如RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達增加,MLCP亞基MYPT1磷酸化增加,以及MLC磷酸化增加。

8、
　　 2.缺氧后內皮細胞HIF-1α蛋白表達明顯增加。
　　 3.缺氧前后內皮細胞緊密連接蛋白occludin的蛋白表達無明顯變化。
　　 4.ROCK特異性抑制劑ROCKOUT在明顯抑制缺氧內皮細胞MLC磷酸化的同時,還能部分抑制缺氧引起的單層內皮細胞通透性增加。
　　 5.常氧條件下HIF-1α誘導劑DMOG不僅明顯誘導內皮細胞HIF-1α蛋白表達增加,還引起ROCKⅡ蛋白表達、MLCP亞基MYPT

9、1磷酸化以及MLC磷酸化的明顯增加,但對內皮細胞緊密連接蛋白occludin的蛋白表達無明顯影響。
　　 6.HIF-1α抑制劑YC-1和寡霉素明顯抑制缺氧內皮細胞HIF-1α蛋白表達,同時能抑制缺氧引起的RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達增加,MLCP亞基MYPT1磷酸化增加以及MLC磷酸化增加,還對缺氧后單層內皮細胞通透性增加也有部分抑制作用;但對缺氧內皮細胞TJ蛋白occludin的蛋白表達無明顯影響。
　　

10、 7.成功構建了HIF-1αRNA干擾表達載體并穩(wěn)定表達于內皮細胞;抑制HIF-1α基因表達后,缺氧所引起的內皮細胞RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ蛋白表達、ROCK激酶活性增加受到抑制,MLCP亞基MYPT1磷酸化以及MLC磷酸化也受到抑制;缺氧單層內皮細胞通透性的增加也被明顯抑制。
　　 三、結論
　　 1.缺氧引起的內皮細胞通透性增加伴有ROCK-MLC磷酸化通路的活化,特異性抑制ROCK活性能明顯抑制MLC磷酸化

11、及通透性增加。ROCK通路活化所引起的MLC磷酸化參與了缺氧時血管內皮通透性增加的發(fā)生。
　　 2.ROCK-MLC磷酸化通路活化所引起缺氧內皮細胞通透性增加伴有HIF-1α蛋白表達增加,而常氧下誘導HIF-1α蛋白表達能引起ROCK-MLC磷酸化通路活化,HIF-1α可能在缺氧內皮細胞ROCK-MLC磷酸化通路活化中具有一定作用。
　　 3.HIF-1α的化學性抑制劑能明顯抑制缺氧引起的內皮細胞ROCK-MLC磷酸化通