GHRH的體外表達和肌肉異位表達對大鼠的促生長分析.pdf

1、生長激素釋放激素(GrowthHormoneReleasingHormone，GHRH)是由下丘腦合成并分泌、存在于人和動物體內(nèi)的一種生物活性物質(zhì)，能夠促進垂體生長激素(GrowthHormone，GH)的合成與分泌。腦外異位分泌的GHRH蛋白，不論是其成熟形式還是截短的多肽形式，都具有生物活性，并且血清中較低水平的GHRH就能很好的促進GH的分泌。肌肉組織常常作為基因治療或基因免疫的靶器官，利用肌肉異位表達GHRH，可以提高動物的生長

2、速度和生產(chǎn)效益。 本研究借鑒基因治療和基因疫苗的原理構(gòu)建了兩種表達豬GHRH的表達質(zhì)?！猵HC和pCM。表達質(zhì)粒pHC含有由CMV極早期啟動子和豬的骨骼肌alpha-肌動蛋白(α-actm)啟動子構(gòu)成的雜合啟動子和雜合內(nèi)含子(intron)，表達質(zhì)粒pCM含有CMV啟動子用來作為對照。在體外，將6種真核表達質(zhì)粒pGD、pGC、pGE、pGB、pHC和pCM轉(zhuǎn)染小鼠成肌細胞C2C12進行瞬時表達，另外用不含GHRHcDNA序列的

3、空質(zhì)粒p5f3f作為陰性對照。轉(zhuǎn)染后C2C12細胞經(jīng)2％馬血清誘導(dǎo)分化為肌管細胞，分別在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h提取細胞總RNA和收集細胞培養(yǎng)上清，采用RT-PCR和Northernblot檢測GHRH在mRNA水平上的表達，RIA和Westernblot檢測GHRH在蛋白水平上的表達，結(jié)果表明GHRH基因得到了成功表達并分泌到細胞外，并且，pCM載體的表達活性高于其他幾種載體的表達活性。體內(nèi)大鼠實驗共分為7組(25只/組)

4、，包括6個質(zhì)粒處理組(0.2mg質(zhì)粒溶于0.2mlPBS中)和一個對照組(0.2mlPBS)，通過直接肌肉注射異位表達GHRH。結(jié)果表明，6種GHRH表達質(zhì)粒pHC、pGD、pGC、pGE、pCM和pGB對大鼠的生長是有促進作用的，增重提高率分別為6.42％、5.83％、5.32％、2.87％、1.11％和0.35％。從5天的階段性增重結(jié)果來看，在5-10天，pHC質(zhì)粒處理組大鼠的增重效果顯著，為40.73±0.88g而對照組為35.5

5、6±1.23g，p＜0.05：在10-15天，pHC質(zhì)粒處理組增重效果顯著，為37.49±2.85g而對照組為33.00±1.56g，p＜0.05；在15-20天，pGC組和pGB組效果顯著，分別為28.66±1.39g和26.78±1.40g，而對照組為21.77±1.27g，p＜0.05。同時，質(zhì)粒處理組大鼠血清IGF-I水平高于對照組。組織切片檢查和血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，通過肌肉注射GHRH表達質(zhì)粒沒有對大鼠造成不良影響。

6、 另外，將肌細胞特異表達基因的幾種調(diào)控元件序列：肌細胞-特異增強子結(jié)合核因子(MEF-1)、MEF-2、轉(zhuǎn)錄增強因子-1(TEF-1)和血清反應(yīng)元件位點(SRE)，經(jīng)過組合成合成啟動子元件，構(gòu)建成表達載體pSP，以用來作為一種對照。通過在體外轉(zhuǎn)染C2C12細胞，進行了瞬時表達，經(jīng)Northernblot和RIA檢測，結(jié)果表明，pSP質(zhì)粒在C2C12細胞中表達較高水平的GHRH，接近于CMV啟動子質(zhì)粒pCM的表達水平。 通過本