大鼠脊髓機(jī)械性損傷后iNOS的變化與細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其法醫(yī)學(xué)意義.pdf

1、目的：脊髓損傷(spinal cord injury)是臨床及法醫(yī)學(xué)中常見的致死、致殘性損傷,主要由交通事故、高空墜落、重物砸傷等致病因素引起。脊髓的損傷可以造成損傷平面以下運(yùn)動、感覺、自主神經(jīng)功能障礙,是一種嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量的致殘性損傷,因此對神經(jīng)細(xì)胞死亡及功能修復(fù)機(jī)理的研究具有十分重要的意義。此外,雖然脊髓損傷致死的案件在法醫(yī)實(shí)踐中時常見到,但目前尚無推斷脊髓損傷時間的確切方法,為尋求更加準(zhǔn)確可靠的檢測方法,越來越多的學(xué)者

2、將分子生物學(xué)技術(shù)運(yùn)用到法醫(yī)學(xué)研究中。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是一種非鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性酶,是一氧化氮合酶(NOS)的一種亞型。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)在正常生理情況下較少表達(dá),但當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)炎癥、氧化反應(yīng)時,iNOS將起關(guān)鍵作用,iNOS也是誘導(dǎo)遲發(fā)性細(xì)胞凋亡的主要因子。Sinz運(yùn)用RT-PCR檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的mRNA在外傷性腦損傷動物模型中的變化,發(fā)現(xiàn)iNOS在傷后的表達(dá)存在一定的時序性規(guī)律。查閱國內(nèi)外文獻(xiàn),在動

3、物脊髓損傷模型中關(guān)于iNOS的研究比較少見。細(xì)胞凋亡(apoptosis)是程序性細(xì)胞死亡,是一種正常的積極主動的生理過程,首先細(xì)胞接收、識別某種特殊生理或病理性信號,然后啟動細(xì)胞凋亡特有的基因,再通過mRNA的轉(zhuǎn)錄合成某種有致死效應(yīng)的蛋白質(zhì),最終導(dǎo)致了細(xì)胞的解體、死亡、形成凋亡小體。近年來切斷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的途徑成為減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及恢復(fù)神經(jīng)功能的研究熱點(diǎn)。李興彪等研究表明閉合性小腦挫傷后不同損傷時間細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化可以為法醫(yī)學(xué)早期

4、損傷時間推斷提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：⑴將54只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為對照組和8個實(shí)驗(yàn)組,每組6只。實(shí)驗(yàn)組按3小時、6小時、12小時、1天、3天、5天、7天、14天8個時間點(diǎn)分組。⑵采用自制改良的Allen's打擊設(shè)備,制作脊髓機(jī)械性損傷模型。記錄損傷后大鼠行為學(xué)變化,在相應(yīng)的時間點(diǎn)處死大鼠取出損傷段脊髓。⑶觀察各實(shí)驗(yàn)組病理變化;采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測各大鼠脊髓中iNOS的表達(dá)情況:采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUN

5、EL)檢測脊髓細(xì)胞凋亡的表達(dá)情況。⑷所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表達(dá),采用SPSS12.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用單因素方差分析方法,組內(nèi)比較采用配對T檢驗(yàn)(LsD-t),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　 結(jié)果：①大鼠脊髓組織HE染色結(jié)果:對照組脊髓灰質(zhì)及白質(zhì)分界清晰,神經(jīng)元細(xì)胞核大著色均勻。各實(shí)驗(yàn)組病理改變不同:損傷早期(3h-3d)脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)可見出血點(diǎn);神經(jīng)元腫脹,體積增大,核膜不清,周圍出現(xiàn)空隙;毛細(xì)血管擴(kuò)張充

6、血,炎細(xì)胞附壁。損傷3d以后可見脊髓組織疏松,神經(jīng)元數(shù)量減少,膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生,14d組織損傷處灰白質(zhì)分界漸清,水腫及出血消失,有炎細(xì)胞浸潤,纖維組織增生。②免疫組化檢測iNOS陽性細(xì)胞表達(dá)結(jié)果:對照組:僅見少量iNOS陽性細(xì)胞。各實(shí)驗(yàn)組:損傷后各實(shí)驗(yàn)組灰質(zhì)內(nèi)iNOS陽性細(xì)胞表達(dá)明顯多于白質(zhì),損傷后3h即有表達(dá),3d表達(dá)較強(qiáng),7d達(dá)到高峰,14d組表達(dá)明顯下降。各損傷組與對照組比較,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。③TUNEL

7、檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果:對照組:未見細(xì)胞凋亡;實(shí)驗(yàn)組:3h、6h組未見細(xì)胞凋亡,12h可見極少量細(xì)胞凋亡,3d、5d表達(dá)逐漸增強(qiáng),7d達(dá)到高峰,14d明顯減少。早期凋亡細(xì)胞主要集中于損傷部位,高峰期損傷周圍亦可見凋亡細(xì)胞。各損傷組與對照組比較,其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：⑴實(shí)驗(yàn)利用自制設(shè)備成功制作了大鼠脊髓機(jī)械性損傷模型,符合人體損傷的實(shí)際情況,達(dá)到了實(shí)驗(yàn)要求。⑵成年大鼠在脊髓急性機(jī)械性損傷刺激下,誘導(dǎo)型一氧