EGCG對(duì)梗阻性腎病大鼠腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、腎臟纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是多種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎臟病的共同通路。本質(zhì)上，腎纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度積聚和沉積為特征的過程，產(chǎn)生基質(zhì)(matrix)的細(xì)胞活化是腎纖維化形成的關(guān)鍵。當(dāng)損傷及炎癥因素持續(xù)存在時(shí)，成纖維細(xì)胞(fibrosis)增殖并產(chǎn)生過量的細(xì)胞外基質(zhì)。此外，腎小球系膜細(xì)胞(mesangial cell)和腎小管上

2、皮細(xì)胞(renal tubularepithelial cell，RTEC)是主要的產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞。腎纖維化早期，系膜細(xì)胞和纖維母細(xì)胞發(fā)生活化，腎纖維化晚期出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，RIF狀態(tài)下的成纖維細(xì)胞約36％來源于腎小管上皮細(xì)胞。近年來，腎小管EMT在腎纖維化中的作用日益受到重視。從器官纖維化發(fā)生機(jī)制入手，尋找有效的防治纖維

3、化的方法，是目前醫(yī)學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。TGF-β1是目前公認(rèn)的最重要的促纖維化和EMT的細(xì)胞因子，因而通過抑制TGF-β1的產(chǎn)生或阻斷其生物活性來抑制EMT，被認(rèn)為是抗腎纖維化的重要靶點(diǎn)。
　　腎間質(zhì)纖維化發(fā)病機(jī)制之一是氧化應(yīng)激(oxidative stress)，在輸尿管梗阻(ureteral obstruction)性腎病的腎間質(zhì)纖維化的動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)抗氧化能力下降;同時(shí)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，雖然不同的生長(zhǎng)因子或細(xì)胞

4、因子引發(fā)各自的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞反應(yīng)，但他們的作用幾乎均通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)這條共同通路來完成，因這些因子可引起細(xì)胞內(nèi)ROS迅速升高;如果抑制ROS生成，則阻斷了外界刺激引起的相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal pathway)，使細(xì)胞增殖(proliferation)等功能受到抑制，因此理論上抗氧化劑對(duì)腎間質(zhì)纖維化有保護(hù)作用。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是強(qiáng)抗氧化劑，有研究發(fā)現(xiàn)EGCG有抗

5、肝臟和胰腺纖維化的作用，而對(duì)于腎臟纖維化和轉(zhuǎn)分化有無影響目前尚無報(bào)道。
　　本研究通過單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)制作梗阻性腎病大鼠模型，觀察腎小管上皮細(xì)胞是否可以發(fā)生轉(zhuǎn)分化，并驗(yàn)證EGCG對(duì)于腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化有無抑制作用;通過TGF-β1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，探討腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并觀察EGCG對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的調(diào)控作用，為治療腎纖維化提供新的理論依據(jù)和方法。
　　實(shí)驗(yàn)材料與方法:
　　

6、一、材料
　　Wistar大鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組（N組），UUO模型組（以單側(cè)輸尿管結(jié)扎制作腎間質(zhì)纖維化模型），和EGCG治療組(該組在單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)后每日給予腹腔注射EGCG5mg/kg)。在3天，7天和14天處死取材。
　　大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，由ATCC引進(jìn)。將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為四組:
　　1組:正常對(duì)

7、照組(N)，以DMEM培養(yǎng)液為空白對(duì)照。
　　2組:TGF-β1誘導(dǎo)組（培養(yǎng)液中TGF-β1的濃度為10ng/ml），
　　3組:EGCG200ug/ml干預(yù)組，培養(yǎng)液中TGF-β1的濃度為10ng/ml，EGCG濃度為200ug/L。
　　4組:EGCG400ug/ml干預(yù)組，培養(yǎng)液中TGF-β1的濃度為10ng/ml，EGCG濃度為400ug/L。
　　各細(xì)胞組在48小時(shí)收集細(xì)胞待測(cè)。同時(shí)1，2，3組進(jìn)行細(xì)胞

8、爬片，48小時(shí)后多聚甲醛固定后待測(cè)。
　　二、方法
　　大鼠腎組織一部分經(jīng)4％的多聚甲醛固定后，用石蠟包埋，切片后用HE染色和Masson染色，觀察病理改變。
　　大鼠腎組織用免疫組化方法檢測(cè)α-SMA、CK-18、TGF-β1，Wstern-blot法檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF-κB的蛋白表達(dá)情況。
　　各組細(xì)胞用免疫組化方法檢測(cè)細(xì)胞爬片α-SMA、CK-18，采用Western-bloting方法檢測(cè)細(xì)胞漿中cycli

9、nD1，MMP9，Pi-Smad3，Pi-ERK，和細(xì)胞核中β-catenin的蛋白表達(dá)。各組細(xì)胞采用Realtime PCR檢測(cè)上述指標(biāo)的mRNA的表達(dá)。
　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一、UUO組及EGCG治療組大鼠腎組織的病理變化
　　HE染色顯示，光鏡下正常對(duì)照組大鼠腎

10、臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管排列緊密整齊，未見腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維增生等改變;UUO組第14天腎小管結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，可見腎小管萎縮，腎小管、集合管擴(kuò)張呈囊狀，管腔塌陷，上皮細(xì)胞大量壞死，腎間質(zhì)彌漫性巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生。EGCG治療組14天上述改變較UUO組14天減輕。
　　Masson染色顯示，假手術(shù)組腎臟膠原染色主要位于小管基膜，UUO組14天膠原沉積明顯增多，腎間質(zhì)增寬，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分增

11、多，腎間質(zhì)纖維化程度明顯加重，腎間質(zhì)纖維組織相對(duì)面積較正常對(duì)照組明顯增大。EGCG治療組14天上述改變較UUO組14天減輕，腎間質(zhì)纖維組織相對(duì)面積較UUO組14天減少。
　　二、EGCG對(duì)UUO大鼠腎組織中CK-18、α-SMA，NF-κB和TGF-β1表達(dá)的影響
　　免疫組化和Western-blot結(jié)果顯示:
　　CK-18的表達(dá)情況:正常對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞胞漿中高表達(dá)，UUO組7天表達(dá)明顯減少，14天減少更明顯

12、;而EGCG治療組CK-18減少的程度比UUO組輕。
　　α-SMA的表達(dá)情況:正常腎組織腎小管上皮細(xì)胞胞漿中幾乎不表達(dá)，UUO組7天和14天高表達(dá)，而EGCG治療組較UUO組表達(dá)減少。
　　NF-κB表達(dá)情況:正常腎組織細(xì)胞核內(nèi)微量表達(dá)，UUO組隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸增多;而EGCG治療組各時(shí)間點(diǎn)較UUO組表達(dá)減少。
　　TGF-β1表達(dá)情況:正常組幾乎不表達(dá)，UUO組7天和14天在腎小管上皮細(xì)胞胞漿中高表達(dá);EGC

13、G治療組各時(shí)間點(diǎn)均較UUO組減少。
　　三、EGCG對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的NRK細(xì)胞CK-18、α-SMA、cyclinD和MMP9表達(dá)的影響
　　免疫組化和Western-blot結(jié)果顯示:
　　NRK細(xì)胞CK-18、α-SMA蛋白的表達(dá)情況:NRK細(xì)胞被TGF-β1誘導(dǎo)48小時(shí)后，胞漿中CK-18蛋白表達(dá)明顯減少，α-SMA蛋白出現(xiàn)了高表達(dá);而NRK細(xì)胞被TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用48小時(shí)后，上述改變減輕。

14、>　　NRK細(xì)胞cyclin D1，MMP9蛋白及其mRNA的表達(dá)情況:NRK細(xì)胞被TGF-β1誘導(dǎo)48小時(shí)后，cyclin D1，MMP9蛋白及其mRNA表達(dá)明顯升高;而NRK細(xì)胞經(jīng)TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用后，上述改變的程度減輕，并且EGCG濃度為400ug/L時(shí)比200ug/L能進(jìn)一步減輕上述蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　四、EGCG對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的NRK細(xì)胞Pi-Smad3，Pi-ERK1/2，β-catenin及其

15、mRNA的影響
　　Western-blot結(jié)果顯示:
　　NRK細(xì)胞漿中Pi-Smad3蛋白及Smad3mRNA表達(dá):NRK細(xì)胞被TGF-β1誘導(dǎo)48小時(shí)后，Pi-Smad3蛋白及Smad3mRNA表達(dá)明顯升高;而NRK細(xì)胞經(jīng)TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用后，上述改變的程度減輕，并且EGCG濃度為400ug/L時(shí)比200ug/L能進(jìn)一步減輕上述蛋白及mRNA的表達(dá)。
　　NRK細(xì)胞漿中Pi-ERK1/2蛋白及ERK2

16、 mRNA表達(dá):NRK細(xì)胞被TGF-β1誘導(dǎo)48小時(shí)后，Pi-ERK1/2蛋白及ERK2 mRNA表達(dá)明顯升高;而NRK細(xì)胞經(jīng)TGF-β1和EGCG聯(lián)合作用后，上述改變的程度減輕，并且EGCG濃度為400ug/L時(shí)比200ug/L能進(jìn)一步減輕上述蛋白及mRNA的表達(dá)
　　NRK細(xì)胞核中β-catenin蛋白及其mRNA的表達(dá):TGF-β1誘導(dǎo)組β-catenin蛋白較正常組表達(dá)明顯升高，EGCG干預(yù)組表達(dá)少于TGF-β1誘導(dǎo)組，并

17、且EGCG濃度400ug/L比200ug/L時(shí)減少更明顯;TGF-β1誘導(dǎo)組β-catenin的mRNA的表達(dá)較正常組減少，EGCG干預(yù)組較TGF-β1誘導(dǎo)組表達(dá)增多，但仍少于正常組。
　　結(jié)論:
　　1、UUO大鼠存在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，EGCG能通過減少TGF-β1的表達(dá)和減少NF-κB的活化，維持腎小管上皮細(xì)胞表型，減輕腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。
　　2、在體外實(shí)驗(yàn)，EGCG以劑量依賴方式抑制MMP9、cyclin