乙酰肝素酶在卵巢癌血管生成中的作用及姜黃素抑制卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、卵巢癌(ovariancarcinoma)發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中僅次于宮頸癌，具有起病隱匿、早期不易發(fā)現(xiàn)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差等特點(diǎn)，其發(fā)生機(jī)制及治療的探索一直是生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。乙酰肝素酶是一種內(nèi)糖苷酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)和基底膜(basementmembrane，BM)中的硫酸乙酰肝素(heparinsulfate，HS)，在惡性腫瘤細(xì)胞中乙酰肝素酶普遍存在，卵巢癌中乙酰肝素酶的表達(dá)及與患

2、者臨床特征的關(guān)系值得進(jìn)一步探索。 實(shí)體腫瘤的生長必須依賴持續(xù)和廣泛的腫瘤血管生成，新生血管為腫瘤組織提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，又是腫瘤組織發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要途徑。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子通過與3種選擇性表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的高親和力酪氨酸受體VEGFR-1(FLT-1)、VEGFR-2(FLK-1)及VEGFR-3(FLT-4)結(jié)合，引起一系列的信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，最終引起新生血管形成，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要

3、作用。 RNAi技術(shù)是一種比較新的生物醫(yī)學(xué)研究方法，將與信使RNA(messengerRNA，mRNA)對(duì)應(yīng)的正義RNA(senseRNA)和反義RNA(anti-senseRNA)組成的雙鏈RNA(doublestrandRNA，dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，可以使mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致相應(yīng)基因的沉默，這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制(post-transcriptionalgenesilencing，，PTGS)被稱為RNA干擾(RNA

4、interference，RNAi)。RNAi技術(shù)將被廣泛應(yīng)用到功能基因組學(xué)、基因治療學(xué)、新藥開發(fā)研究等眾多領(lǐng)域。 姜黃素有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血脂等，是一種具有良好發(fā)展前景的抗癌藥物，其抗腫瘤作用日益引起人們的重視，成為研究的熱點(diǎn)。 本研究擬觀察乙酰肝素酶在卵巢癌血管生成中的作用及姜黃素對(duì)卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響。本實(shí)驗(yàn)分四部分：第一，選擇65例經(jīng)病理確診的卵巢癌患者

5、，采用免疫組化方法檢測癌組織中乙酰肝素酶、VEGF、VEGFR1和F8因子的表達(dá)情況，探尋乙酰肝素酶表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征及腫瘤血管生成的關(guān)系。第二，進(jìn)行卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，觀測其細(xì)胞生物學(xué)特性，采用免疫熒光方法及RT-PCR方法檢測卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞乙酰肝素酶表達(dá)情況。第三，進(jìn)行卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞乙酰肝素酶表達(dá)的RNA干擾實(shí)驗(yàn)，檢測卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞活性、乙酰肝素酶基因mRNA水平及蛋白表達(dá)，VEGF蛋

6、白表達(dá)及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的變化。第四，在卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中加入不同劑量的姜黃素共培養(yǎng)，觀察卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖率等變化，采用免疫熒光染色和RT-PCR法檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞中乙酰肝素酶表達(dá)變化，探討姜黃素對(duì)卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。 主要結(jié)果及結(jié)論如下： 第一部分：卵巢癌乙酰肝素酶表達(dá)特征及與血管生成關(guān)系研究 1.12例正常卵巢組織中乙酰肝素酶無陽性表達(dá)，陽性率為0％，65例卵巢癌中乙酰肝

7、素酶陽性51例，陽性率為78.5％，兩組乙酰肝素酶表達(dá)差異非常顯著。提示卵巢癌中乙酰肝素酶表達(dá)具有腫瘤特異性。 2.＜50歲組27例中21例乙酰肝素酶表達(dá)陽性，陽性率為77.8％，≥50歲組38例中30例陽性，陽性率為78.9％，無顯著性差異。漿液性囊腺癌30例中25例乙酰肝素酶表達(dá)陽性，陽性率為83.3％，粘液性囊腺癌21例中16例陽性，陽性率為76.2％，其他類型14例卵巢癌腺癌中10例陽性，陽性率為71.4％，差異不顯著。

8、提示卵巢癌乙酰肝素酶表達(dá)與卵巢癌組織類型及患者的年齡無相關(guān)性。 3.早期卵巢癌組織12例中乙酰肝素酶陽性3例，晚期卵巢癌組織53例中乙酰肝素酶陽性48例，組間差異顯著。高分化卵巢癌5例中乙酰肝素酶陽性表達(dá)1例，中分化卵巢癌15例中乙酰肝素酶陽性表達(dá)6例，低分化卵巢癌45例中乙酰肝素酶陽性表達(dá)44例，組間差異顯著。提示卵巢癌乙酰肝素酶表達(dá)與卵巢癌病理分級(jí)有顯著相關(guān)性，分化越低的卵巢癌，乙酰肝素酶表達(dá)越強(qiáng)；卵巢癌乙酰肝素酶表達(dá)與卵巢

9、癌臨床分期有顯著相關(guān)性，晚期卵巢癌乙酰肝素酶表達(dá)強(qiáng)于早期卵巢癌。 4.VEGF表達(dá)強(qiáng)度在卵巢癌患者不同年齡組中無顯著區(qū)別，在卵巢癌不同組織學(xué)類型中無顯著差異，臨床晚期卵巢癌中VEGF表達(dá)強(qiáng)度高于早期卵巢癌，高中分化卵巢癌和低分化卵巢癌組VEGF表達(dá)強(qiáng)度顯著不同，以低分化癌組表達(dá)為高。卵巢癌乙酰肝素酶表達(dá)強(qiáng)度變化與VEGF表達(dá)強(qiáng)度呈相同趨勢，統(tǒng)計(jì)分析表明，卵巢癌VEGF表達(dá)強(qiáng)度與乙酰肝素酶表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.647。

10、 5.卵巢癌不同年齡組及不同組織學(xué)類型中VEGFR1表達(dá)強(qiáng)度無顯著區(qū)別，臨床晚期卵巢癌VEGFR1表達(dá)強(qiáng)度顯著高于早期卵巢癌，低分化卵巢癌VEGFR1表達(dá)強(qiáng)度顯著高于高中分化卵巢癌組。統(tǒng)計(jì)分析表明，卵巢癌VEGFR1表達(dá)強(qiáng)度與乙酰肝素酶表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.612。 6.卵巢癌不同年齡組及不同組織學(xué)類型中MVD無顯著區(qū)別，臨床晚期卵巢癌MVD顯著高于早期卵巢癌，低分化卵巢癌MVD顯著高于高中分化卵巢癌。統(tǒng)計(jì)分析表

11、明，卵巢癌MVD與VEGF、VEGFR1及乙酰肝素酶表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.754，0.713和0.669。提示乙酰肝素酶通過釋放、激活VEGF來促進(jìn)血管的生成，乙酰肝素酶和VEGF在卵巢癌新生血管生成過程中發(fā)揮協(xié)同的作用。 第二部分：人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及乙酰肝素酶表達(dá)研究 1.成功進(jìn)行人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察見人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈短梭形或多邊形，細(xì)胞排列緊密，邊界清晰。

12、細(xì)胞活力測定人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力為95％以上。卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞FⅧ因子免疫熒光化學(xué)檢測，細(xì)胞胞漿為綠色熒光，證實(shí)為內(nèi)皮細(xì)胞。為研究腫瘤血管新生機(jī)制及抗血管生成治療提供了理想的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2.乙酰肝素酶表達(dá)免疫熒光染色見乙酰肝素酶主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，胞核未見染色，OdMEC組乙酰肝素酶表達(dá)明顯高于HUVEC組。RT-PCR檢測結(jié)果可見OdMEC組乙酰肝素酶mRNA表達(dá)明顯高于HUVEC組，提示乙酰肝素酶是Od

13、MEC組內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)別于HUVEC組內(nèi)皮細(xì)胞的主要生物學(xué)標(biāo)志之一。 第三部分：RNA干擾沉默乙酰肝素酶基因表達(dá)對(duì)卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞影響實(shí)驗(yàn)研究 1.應(yīng)用含綠色熒光蛋白的載體作對(duì)照轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞乙酰肝素酶siRNA轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到95％以上。提示乙酰肝素酶siRNA得到了高效轉(zhuǎn)染。 2.實(shí)驗(yàn)組以乙酰肝素酶siRNA轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞，并于2、4、6、8d檢測乙酰肝素酶表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞乙酰肝素酶mRN

14、A水平顯著降低、蛋白水平顯著降低(免疫熒光法、WB法)。提示乙酰肝素酶siRNA轉(zhuǎn)染可顯著抑制卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞乙酰肝素酶的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)。 3.乙酰肝素酶siRNA轉(zhuǎn)染后血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF的WB檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度siRNA處理后，隨著時(shí)間增加，VEGF表達(dá)降低，對(duì)照組無顯著改變。提示乙酰肝素酶轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)受抑制后降低了VEGF的表達(dá)。 4.MTT法檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶siRNA轉(zhuǎn)染后血管內(nèi)皮細(xì)

15、胞活力降低，隨著時(shí)間增加，MTT檢測吸光度值變化不大，而正常組和對(duì)照組隨時(shí)間增加呈上升趨勢。細(xì)胞增殖指數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶siRNA轉(zhuǎn)染后血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖指數(shù)顯著下降。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)乙酰肝素酶siRNA轉(zhuǎn)染后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著上升。提示RNAi可有效沉默血管內(nèi)皮細(xì)胞乙酰肝素酶表達(dá)，降低VEGF表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，RNAi可能為腫瘤治療提供新的途徑。 第四部分：姜黃素對(duì)卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特

16、性及乙酰肝素酶表達(dá)的影響 1.細(xì)胞形態(tài)觀察見姜黃素組培養(yǎng)細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞生長密度減小，細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，折光性減低，隨姜黃素濃度增加可見細(xì)胞脫落、脫壁漂浮甚至破碎現(xiàn)象，72h可見細(xì)胞成大片脫落，有明顯的時(shí)間和濃度依賴關(guān)系。提示姜黃素(2-250μg/ml)能顯著抑制人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，具有劑量和時(shí)間依賴性。 2.細(xì)胞生長抑制率檢測結(jié)果表明，姜黃素對(duì)卵巢癌血管內(nèi)皮細(xì)胞抑制作用明顯，與陰性對(duì)照比較差異顯著，有顯著

17、的劑量依賴效應(yīng)。姜黃素組對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖指數(shù)影響檢查可見姜黃素組細(xì)胞增殖指數(shù)顯著下降，同時(shí)觀察到G0/G1期前出現(xiàn)明顯亞二倍體峰，即凋亡峰。提示姜黃素(2-250μg/ml)能顯著抑制人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性，降低增殖指數(shù)，具有劑量和時(shí)間依賴性。 3.免疫熒光法檢測內(nèi)皮細(xì)胞乙酰肝素酶表達(dá)結(jié)果顯示，姜黃素組內(nèi)皮細(xì)胞乙酰肝素酶表達(dá)顯著下降，有顯著的劑量依賴抑制效應(yīng)。提示姜黃素(2-250μg/ml)能顯著降低人卵巢癌微血管