肺炎支原體P1重組蛋白的提取純化及其在血清學(xué)檢測中的初步應(yīng)用.pdf

1、肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae，Mp)不僅可以引起肺炎、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病，還可導(dǎo)致多種肺外感染和并發(fā)癥。由于肺炎支原體分離和體外培養(yǎng)困難而使分離培養(yǎng)法不適用于該病原體感染的診斷。血清學(xué)方法和PCR技術(shù)雖然是目前檢測Mp感染的主要方法，但是傳統(tǒng)血清學(xué)方法使用Mp全菌體成分做抗原，存在敏感性低，易出現(xiàn)交叉反應(yīng)等缺點(diǎn)，影響診斷效果；PCR技術(shù)存在操作復(fù)雜、成本較高及非特異反應(yīng)等弊端也不適合臨床應(yīng)用。本研究應(yīng)用基因工程

2、技術(shù)制備肺炎支原體特異性重組蛋白抗原，用間接ELISA方法檢測肺炎支原體抗體，并與Mp全菌抗原的檢測結(jié)果進(jìn)行了比較，考察其在臨床診斷方面的應(yīng)用價值，以期為臨床診斷肺炎支原體感染提供新型經(jīng)濟(jì)適用的檢測方法和試劑。 方法: 1、重組蛋白的提取和純化pGEX-6P-1-P1，重組克隆株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，離心收集菌體沉淀后，用B-PERGST融合蛋白純化試劑盒提取、純化Mp P1重組蛋白。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其分子量與純度，

3、 Western blotting分析其抗原特異性。 2、肺炎支原體菌體抗原的制備Mp FH菌株培養(yǎng)按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行，將培養(yǎng)物離心后收集沉淀的菌體，經(jīng)超聲粉碎，獲得Mp全菌抗原。 3、間接ELISA檢測患者血清中Mp IgG抗體采用方陣滴定法確定抗原最佳工作濃度以重組蛋白做抗原，按照確定的抗原最佳工作濃度包被酶標(biāo)板，建立間接ELISA法，采用比率法對其結(jié)果進(jìn)行判定。 4、抗原精密度檢驗(yàn)及敏感性、特異性檢驗(yàn)按

4、上述確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件對同一份陽性及陰性混合血清重復(fù)檢測20次，計(jì)算OD<,492>值的變異系數(shù)(CV)值。將重組蛋白抗原和肺炎支原體全菌抗原分別作為包被抗原，檢測51份臨床診斷Mp感染患者血清和40份正常獻(xiàn)血者血清及6份其他非Mp呼吸道病原體感染陽性血清的IgG抗體。 結(jié)果: 1、重組蛋白表達(dá)和活性檢測結(jié)果提取的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE可見誘導(dǎo)表達(dá)的樣品在分子量大約59kDa．處有明顯條帶。免疫印記雜交結(jié)果顯示，兔抗

5、Mp多價抗體與純化的重組蛋白在59kDa處形成了特異的抗原抗體反應(yīng)條帶，空白對照沒有條帶，說明該重組蛋白可被兔抗Mp多價抗體識別，含有肺炎支原體的抗原決定簇。 2、最佳抗原包被濃度結(jié)果經(jīng)方陣滴定法確定了重組蛋白和Mp全抗原的最佳包被濃度分別為1：1000(2.3μg/ml)和1：200(36μg/ml)。 3、精密度檢驗(yàn)結(jié)果精密度檢驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)由P1重組蛋白建立的間接ELISA方法具有較好的重復(fù)性。 4、抗原敏

6、感性及特異性檢驗(yàn)結(jié)果 (1)敏感性檢驗(yàn)51份臨床血清標(biāo)本(日本明膠凝集診斷試劑檢測Mp抗體效價1：40~320)由P1重組蛋白抗原檢測陽性31份，陽性率為60.78％；Mp檢測陽性20份，陽性率為39.22％。經(jīng)配對X<'2>檢驗(yàn)證結(jié)果表明，由P1重組蛋白抗原建立的ELISA檢測方法檢測患者血清特異性抗體的檢出率明顯高于全Mp抗原的檢出率，兩者差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 (2)特異性檢驗(yàn)用上述的重組蛋白和全M