藥物難治性癲癇耐藥機(jī)制中PGP和MRP1作用的研究.pdf

1、藥物難治性癲癇耐藥機(jī)制中PGP和MRP1作用的研究 研究背景： 在過去的20年中，盡管不斷有新的抗癲癇藥(antieoilepticdrugs，AEDs)投入臨床應(yīng)用，但仍有30％左右的癲癇患者對(duì)AEDs不敏感，出現(xiàn)難以被控制的反復(fù)發(fā)作，臨床上稱之為難治性癲癇。難治性癲癇的預(yù)后不佳，有較高的致殘和致死率。因此研究難治性癲癇對(duì)ADs產(chǎn)生耐藥的原因，發(fā)現(xiàn)新的治療措施，具有重要意義。在腫瘤化療的過程中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期接觸某一種化療藥

2、物產(chǎn)生的不僅對(duì)此種化療藥物耐藥，而且可對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功能不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性的現(xiàn)象，此被稱為多藥耐藥(multidrugresistance.,MDR。研究表明腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體，能夠?qū)⒒熕幬锉贸黾?xì)胞外，減少了腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，參與了腫瘤耐藥的發(fā)生。同樣情況也出現(xiàn)在難治性癲癇上，通常如果患者對(duì)一種AD耐受，他往往也對(duì)其它的AEDs不敏感。研究發(fā)現(xiàn)難治性癲癇耐藥和腫瘤耐藥之間存在相同的病理機(jī)制。目前研究認(rèn)為在生理

3、條件下人體血腦屏障(blood-brainbarrier,BBB)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞上就有多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，而在難治性癲癇患者病灶切除的標(biāo)本發(fā)現(xiàn)血腦屏障上有高表達(dá)的多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體。進(jìn)一步對(duì)其功能的研究發(fā)現(xiàn)，多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體是一類ATP結(jié)合蛋白質(zhì)超家族，能夠識(shí)別多種作用機(jī)制不同的AEDs，主動(dòng)將藥物泵出到血腦屏障以外。因此認(rèn)為，難治性癲癇患者腦內(nèi)多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)增高，引起ADs通過血腦屏障障礙，患者腦內(nèi)ADs濃度下降，可能參與了難治性癲癇多藥

4、耐藥的發(fā)生。P．糖蛋白(P-glycoprotein,PGP)和多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multi-drugresistanceassociatedprotein,MRP1)是被人們研究最早的兩種多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體。本課題通過觀察難治性癲癇患者和模型大鼠腦內(nèi)PGP、MRP1的表達(dá)和分布；采用PGP、MRP1特異性拮抗劑維拉帕米(verapamil，Ver)和丙磺舒(probenecid，Pro)觀察PGP和MRPl對(duì)苯妥英鈉(phenytoin,P

5、HT)和卡馬西平(carbamazepine,CBZ)通過癲癇大鼠血腦屏障的影響；PGP對(duì)體外培養(yǎng)的耐藥細(xì)胞內(nèi)PHT和CBZ濃度的影響以及PGP對(duì)慢性杏仁核點(diǎn)燃模型大鼠電生理和行為的影響。在形態(tài)和功能不同角度研究PGP、MRPl在難治性癲癇多藥耐藥機(jī)制中的作用。 材料與方法： 本文共分四部分：第一部分建立慢性杏仁核點(diǎn)燃癲癇動(dòng)物模型，采用RT-PCR、免疫組化和Westerm-blot的方法，觀察難治性癲癇患者和模型大鼠腦

6、內(nèi)PGP、MRPlmRNA和蛋白的表達(dá)。第二部分采用微透析技術(shù)和高效液相色譜技術(shù)，通過腹腔注射PHT和CBz，觀察在癲癇和正常大鼠皮層細(xì)胞外液AEDs的濃度差異；觀察腦內(nèi)局部給予PGP拮抗劑Ver和MRPl拮抗劑Pro后，癲癇大鼠皮層細(xì)胞外液中AEDs的濃度變化。第三部分建立PGP高表達(dá)的K562/Dox耐藥細(xì)胞株，比較耐藥細(xì)胞株和PGP表達(dá)陰性的K562細(xì)胞株對(duì)PHT和CBZ的攝?。河^察給予Ver后，耐藥細(xì)胞內(nèi)AEDs的濃度變化。第四

7、部分在杏仁核電點(diǎn)燃模型上，觀察Ver對(duì)耐PHT和CBZ大鼠的后放電閾值(afterdischargethreshold,ADT)、后放電時(shí)程(afterdischargeduration.ADD)等電生理指標(biāo)和行為學(xué)的影響。結(jié)果： 第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：L與對(duì)照組相比，難治性癲癇患者和大鼠腦內(nèi)皮層和海馬PGPmRNA和蛋白表達(dá)顯著增高(P＜O.05)。2．與對(duì)照組相比，難治性癲癇大鼠腦內(nèi)皮層和海馬MRPlmRNA和蛋白表達(dá)顯著增高(

8、P

9、O．05)；在給藥后30min．150min各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的皮層細(xì)胞外液CBz濃度也明顯降低(P＜O．05)。2．給予PGP拮抗劑Ver后增加了癲癇大鼠皮層細(xì)胞外液中PHT和CBZ的濃度，和對(duì)照組相比，PHT濃度在腹腔給藥后15min．180min各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯著增高(P

10、BZ的藥物濃度，和對(duì)照組相比，PHT濃度在腹腔給藥后15min．180min各個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著增高(P＜O．05)，CBz濃度在給藥后45min．120min各個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著增高(P＜O．05)。 第三部分試驗(yàn)結(jié)果：LPHT和CBZ對(duì)K562/Dox細(xì)胞株(PGP高表達(dá))的半數(shù)抑制濃度(IC50)明顯高于K562細(xì)胞株(PGP表達(dá)陰性)；加入Ver后，PHT和CBZ對(duì)K562/Dox細(xì)胞的IC50明顯下降，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2．5和1．5

11、。2．K562/Dox細(xì)胞內(nèi)PHT和CBZ的濃度均顯著少于其藥敏K562細(xì)胞，僅分別為正常K562細(xì)胞的23．6％和32．2％。當(dāng)加入Ver后，K562/Dox細(xì)胞內(nèi)AEDs濃度明顯升高(P＜0．05)。 第四部分試驗(yàn)結(jié)果：L耐藥組大鼠在給予Ver后，ADT明顯高于對(duì)照組(P＜O．05)。2．相對(duì)于對(duì)照組，耐藥組大鼠在給予Ver后，ADD時(shí)程明顯縮短，Racine行為分級(jí)明顯下降CP<0．05)。 結(jié)論： 1．慢

12、性杏仁核電點(diǎn)燃癲癇模型大鼠腦內(nèi)皮層和海馬存在多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體PGP和MRPl的表達(dá)升高；難治性癲癇患者腦內(nèi)皮層和海馬存在多藥轉(zhuǎn)運(yùn)體PGP和MRPl的表達(dá)升高。 2．P凹和MRPl具有限制PHT和CBZ通過血腦屏障的作用，引起癲癇大鼠大腦皮層細(xì)胞外液中AEDs濃度下降，參與了難治性癲癇的耐藥機(jī)制。 3．P凹和MRPl的拮抗劑Ver和Pro可以提高腦內(nèi)細(xì)胞外液和細(xì)胞內(nèi)AEDs的濃度，同時(shí)Ver可以協(xié)助AEDs改善耐藥大鼠的電生理活