糖原合酶激酶-3對(duì)蛋白磷酸酯酶-2A催化亞基磷酸化和甲基化修飾的調(diào)節(jié)及機(jī)制.pdf

1、蛋白磷酸酯酶-2A（PP2A）是一種在真核細(xì)胞中普遍存在的絲/蘇氨酸磷酸酯酶，它參與細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)途徑。PP2A的核心酶由一個(gè)催化亞基C和結(jié)構(gòu)亞基A組成，這個(gè)核心酶可以和不同的調(diào)節(jié)B 亞基結(jié)合形成具有不同催化功能的全酶。PP2A 催化亞基翻譯后磷酸化和甲基化修飾可影響PP2A活性的調(diào)節(jié)。PP2A 催化亞基Tyr307位點(diǎn)經(jīng)蛋白酪氨酸激酶（如Src）磷酸化后活性下降；催化亞基Leu309位點(diǎn)可以被PP2A特異性甲基轉(zhuǎn)移酶(PPMT1)/甲

2、酯酶（PME-1）甲基化/去甲基化修飾調(diào)節(jié)，甲基化后可增強(qiáng)PP2A活性，去甲基化則使PP2A活性降低。PP2A與糖原合酶激酶-3（GSK-3）是微管相關(guān)蛋白Tau 磷酸化修飾最為重要的蛋白磷酸酯酶和磷酸激酶，它們調(diào)節(jié)的失衡可造成Tau 過(guò)度磷酸化，導(dǎo)致AD的病理學(xué)改變。在阿爾茨海默病患者腦中PP2A活性下降，其具體機(jī)制尚不明確。我們課題組已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，GSK-3可上調(diào)蛋白磷酸酯酶抑制因子-2 (I2PP2A)的表達(dá)水平而下調(diào)PP2A活性，G

3、SK-3與I2PP2A 相關(guān)系數(shù)R=0.9158，GSK-3活性與PP2A活性成負(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.9166，而I2PP2A與PP2A 負(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.7164。這些研究結(jié)果提示，GSK-3 很可能還通過(guò)其他途徑調(diào)節(jié)PP2A活性。
　　 目的：為了進(jìn)一步探討GSK-3對(duì)PP2Ac 翻譯后的調(diào)節(jié)機(jī)制，我們?cè)谡w水平改變GSK-3的活性，在細(xì)胞水平增加GSK-3的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)PP2A 催化亞基磷酸化和甲基化水平變化來(lái)進(jìn)一步闡明GS

4、K-3對(duì)PP2A 催化亞基的翻譯后修飾調(diào)節(jié)的可能機(jī)制。
　　 方法：整體水平采用Sprague Dawley（SD）大鼠，側(cè)腦室定位注射GSK-3 拮抗劑SB216763(SB)和激動(dòng)劑wortmannin(WT)，分組如下：人工腦脊液對(duì)照組、70μM SB給藥組，100μM WT 給藥組，側(cè)腦室定位注射GSK-3 拮抗劑SB216763(SB)和激動(dòng)劑wortmannin(WT)，在注射24 小時(shí)后，麻醉灌流取材，免疫組化方法

5、檢測(cè)PP2Ac、PP2Ac磷酸化和去甲基化水平的變化；細(xì)胞水平采用HEK293/wt細(xì)胞系，用構(gòu)建好的野生型GSK-3β質(zhì)粒體轉(zhuǎn)染24 小時(shí)后提取蛋白，用免疫印跡（western blot）檢測(cè)PP2Ac去甲基化、磷酸化及相關(guān)酶表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：給予GSK-3 拮抗劑SB216763 處理后，PP2Ac表達(dá)水平升高，PP2Ac 去甲基化水平和磷酸化水平降低。給予PI3-Kinase抑制劑WT 處理后，PP2Ac表達(dá)水