紫花地丁黃酮苷類成分的定性定量研究.pdf

1、中藥紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Violayedoensis Makino的干燥帶根全草，為多年生草本，分布于我國大部分地區(qū)，朝鮮、俄羅斯、日本等也有分布。紫花地丁味苦、辛，性寒，歸心、肝經;具有清熱解毒，涼血消腫等功效;可用于治療疔瘡腫毒、癰疽發(fā)背、丹毒、蛇毒咬傷等。現(xiàn)代藥理學研究表明其具有抑菌、抗炎、抗內毒素、調節(jié)免疫、抗氧化、抑制HIV病毒等作用。臨床上主要用于治療各種炎癥，包括扁桃體炎、蜂窩組織炎、流行性腮腺炎、皮膚急性化膿性炎

2、癥等。其化學成分復雜，含有黃酮及其苷類、香豆素類、糖類、有機酸類等多種有效成分，并富含多種微量元素。其中黃酮類及香豆素類化合物是紫花地丁最為主要的活性成分。
　　本研究首次從抗病毒（流感病毒及皰疹病毒）、抗菌（大腸桿菌及金黃色葡萄球菌等）、抗氧化（清除DPPH自由基）等方面系統(tǒng)地對紫花地丁的“解毒”作用部位進行篩選。發(fā)現(xiàn)紫花地丁各個不同極性的提取物均不具有體外抗流感病毒和皰疹病毒的作用;在抗菌方面，雖有文獻報道其具有較強的抗菌活性

3、（包括鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬巴氏桿菌、沙門氏菌、表皮葡萄球菌等），但本研究發(fā)現(xiàn)其只對大腸桿菌顯示出一定的抑制活性，而對其他菌沒有明顯的抑制活性;在抗氧化活性上，其醇提物的乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位具有較好的活性。以上結果表明紫花地丁的“解毒”作用主要表現(xiàn)在抗菌和抗氧化作用上，其解毒活性部位為醇提物的乙酸乙酯部位和正丁醇部位。
　　鑒于課題組前期已對紫花地丁醇提物的石油醚部位和乙酸乙酯部位進行過系統(tǒng)的化學成分研究

4、，本研究主要對其具抗氧化活性和抗菌活性的正丁醇部位進行系統(tǒng)的化學成分研究，運用多種色譜分離方法，共分離鑒定了11個化合物，其中包括6個黃酮碳苷類化合物，分別為芹菜素-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷(1)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(2)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-L-阿拉伯糖苷(3)、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-β-D-木糖苷(4)、芹菜素-6-C-α-L-阿拉伯糖-8-C

5、-β-D-木糖苷(5)和芹菜素-6，8-二-C-α-L-阿拉伯糖苷(6);3個黃酮氧苷類化合物，分別為山奈酚-3-O-β-D-槐糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(7)、山奈酚-3，7-O-α-L-二鼠李糖苷(8)和山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(9);另外還分離得到了腺苷(10)以及秦皮乙素(11)。其中化合物8為首次從該植物中分離得到，化合物4和7為首次從堇菜屬ViolaL.植物中分離得到。
　　本研究對分

6、離得到的11個單體化合物進行了清除DPPH自由基的活性測定，發(fā)現(xiàn)香豆素類化合物秦皮乙素的抗氧化作用最強，黃酮碳苷和氧苷的活性較弱;3個黃酮氧苷類化合物的抗氧化活性比較接近，且均強于黃酮碳苷類成分。對紫花地丁中含量較高的兩個黃酮碳苷類化合物首次進行了抗菌活性測定，發(fā)現(xiàn)均不具有抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)及綠膿桿菌的作用。以上結果表明黃酮碳苷類化合物不具有抗菌活性，但具有一定的抗氧化活性。<

7、br>　　紫花地丁中所含黃酮碳苷類化合物極性較大、結構相近、分離難度大、結構鑒定需要量大且一般需在高溫下進行測定，采用傳統(tǒng)的分離方法僅能對紫花地丁中含量較高的黃酮碳苷類化合物進行結構鑒定，因此本研究首次采用高效液相色譜-光電二極管陣列檢測-電噴霧離子化-離子阱質譜(HPLC-PDA-ESI-IT-MSn)聯(lián)用技術對紫花地丁中黃酮碳苷類化合物進行結構表征，探討紫花地丁黃酮碳苷特別是雙糖碳苷類化合物的質譜裂解規(guī)律，在對5個黃酮碳苷類對照品質

8、譜裂解規(guī)律的研究中發(fā)現(xiàn):1）對這些化合物進行了MS1-10級質譜分析，發(fā)現(xiàn)其MS1-5級質譜表現(xiàn)出該類化合物良好的結構特征;2）與文獻報道一致，在MS2和MS3級質譜中發(fā)現(xiàn)黃酮碳苷類化合物的診斷離子0，2X-;3）MS3中的基峰0，2X0，2X-碎片離子可以作為苷元的診斷離子，MS2和MS3中的[M-60-H]-、[M-90-H]-碎片離子可以作為含五碳糖的診斷離子，[M-120-H]-碎片離子可以作為六碳糖的診斷離子;4）當黃酮雙糖碳

9、苷C-8位糖基為非優(yōu)勢構象時，會優(yōu)先發(fā)生C-8位糖基的開環(huán)反應，此規(guī)律與文獻報道的黃酮碳苷類化合物一般C-6位糖基優(yōu)先斷裂的發(fā)現(xiàn)不一致。我們將該MS1-5裂解規(guī)律用于紫花地丁中該類化合物的檢測與結構表征，并結合該類化合物PDA特征圖譜以及保留時間，從紫花地丁醇提物正丁醇部位共檢測出黃酮苷類化合物35個，包括3個黃酮氧苷類和32個黃酮碳苷類化合物（其中包括1個黃酮單糖碳苷、26個黃酮雙糖碳苷和5個乙?；S酮雙糖碳苷類化合物）。我們首次從紫

10、花地丁中檢測出了乙?；S酮碳苷。因此，我們首次建立的LC-MSn法可以對紫花地丁中的黃酮苷，特別是黃酮碳苷類化合物進行有效的檢測和結構表征。
　　紫花地丁中的黃酮苷類特別是碳苷類成分極性大，含量低、傳統(tǒng)色譜方法較難以分離，因此，結合黃酮碳苷類化合物的質譜裂解規(guī)律，我們首次采用了HPLC-ESI-IT-MS/MS法結合微波輔助萃取和固相萃取法，對紫花地丁中的3個主要黃酮碳苷類成分芹菜素-6，8-二-C-β-D-葡萄糖苷(S1)、芹菜

11、素-6-C-β-D-葡萄糖-8-C-α-L-阿拉伯糖苷(S2)和芹菜素-6，8-二-C-α-L-阿拉伯糖苷(S3)進行了定量分析。采用SRM模式，色譜柱為Waters C18色譜柱(2.1×100 mm，1.7μm)，流動相為乙腈-水，梯度洗脫(0 min，A=5％;0～30 min，A=5％～12％;30～40min，A=12％～13％;40～45min，A=13％～100％)，流速為180μL/min。以上3種成分線性范圍分別為0.