基于仿高密度脂蛋白納米載體的成像指導(dǎo)下的RNA干擾治療研究.pdf

1、腫瘤是威脅人類生命健康的重要疾病之一?；谛「蓴_RNA（siRNA）的基因干擾治療是近十年來(lái)發(fā)展的一種新型腫瘤治療策略。由于其特異性強(qiáng)、副作用小和敏感度高，被認(rèn)為是攻克癌癥最具潛力的手段之一，目前已有9種以上的基因干擾治療方案進(jìn)入臨床試驗(yàn)。盡管siRNA在腫瘤治療上初露鋒芒，但是其高效靶向運(yùn)輸和胞漿內(nèi)釋放仍是RNA干擾技術(shù)在腫瘤基因治療中應(yīng)用的主要限速步驟，即如何通過(guò)全身系統(tǒng)性給藥高效地將siRNA靶向運(yùn)輸?shù)侥[瘤組織細(xì)胞中去，并有效地釋

2、放到細(xì)胞胞漿中以發(fā)揮其功能。此外，為了更好地提高療效、優(yōu)化治療方案以及盡早實(shí)時(shí)評(píng)估治療效果，如何通過(guò)各種成像手段實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)運(yùn)輸過(guò)程以及評(píng)估靶向組織細(xì)胞中siRNA攝取量也成為此療法中的另一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。
　　為了滿足上述需求解決各種問(wèn)題，本研究以一種超小粒徑（<30 nm）的非陽(yáng)離子化脂質(zhì)納米材料為載體，并且利用其良好的腫瘤組織穿透能力、低生物毒性以及直接胞漿藥物釋放機(jī)制，通過(guò)裝載近紅外熒光探針以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)定量監(jiān)測(cè)siRNA運(yùn)輸和攝

3、取過(guò)程將會(huì)顯著提高基因干擾治療抗腫瘤的療效。
　　本課題主要內(nèi)容為研發(fā)了一種超小粒徑的多功能仿高密度脂蛋白人工多肽-納米載體（HPPS），發(fā)現(xiàn)其具有良好的生物相容性、穿透能力、和直接胞漿藥物釋放能力。研究?jī)?nèi)容主要分為三個(gè)部分：
　　1）HPPS直接胞漿藥物釋放機(jī)制研究：直接胞漿藥物釋放機(jī)制在很多小分子療法中有著不可忽視的巨大優(yōu)勢(shì)，所以第一部分研究?jī)?nèi)容是在體用多種熒光染料標(biāo)記以及各種抑制劑選擇性抑制來(lái)研究這種納米載體的胞漿釋放

4、機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn) HPPS疏水性核藥物胞漿運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程是依賴于細(xì)胞表面B族I型清道夫受體（SR-BI受體），不需要整個(gè)納米顆粒內(nèi)化的兩個(gè)步驟的過(guò)程。首先，HPPS先與SR-BI受體結(jié)合，這個(gè)過(guò)程能夠通過(guò)過(guò)量的HDL來(lái)競(jìng)爭(zhēng)性抑制。其次，HPPS可能與SR-BI上Cys384位點(diǎn)相互作用，這個(gè)過(guò)程能夠被BLT-1抑制劑阻斷。HPPS在與受體結(jié)合過(guò)程中仍保持完整的結(jié)構(gòu)，但在與SR-BI相關(guān)位點(diǎn)相互作用時(shí)解離。最后疏水性藥物分子主要是通過(guò)一種類脂筏

5、/小凹介導(dǎo)的內(nèi)吞運(yùn)動(dòng)被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞胞漿，這個(gè)過(guò)程能夠被 filipin或者 MβCD所抑制但不是一個(gè)能量依賴的過(guò)程。HPPS的一些其他成分，例如脂質(zhì)和多肽則被留在了細(xì)胞膜表面。這種獨(dú)特的胞漿運(yùn)輸機(jī)制能夠?yàn)槿蘸蟾咝н\(yùn)輸藥物-提高療效提供一種有用的策略。
　　2）HPPS全身系統(tǒng)性給藥運(yùn)輸siRNA及其RNA干擾抗腫瘤療效研究：在弄清楚胞漿釋放機(jī)制之后，接下來(lái)研究HPPS在裸鼠皮下腫瘤模型中在體運(yùn)輸siRNA及其基因干擾抗腫瘤療效。研究

6、發(fā)現(xiàn)HPPS能夠延長(zhǎng)chol-siRNA在血液中的循環(huán)時(shí)間，改善它的生物分布模式，也能夠促進(jìn)chol-siRNA在KB皮下腫瘤中的攝取。在功能性研究中，HPPS-chol-si-bcl-2能夠下調(diào)在腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)量并因此誘導(dǎo)腫瘤組織的凋亡。最終與游離chol-si-bcl-2相比，抑制了腫瘤生長(zhǎng)。除此之外，在整個(gè)治療過(guò)程中，沒(méi)有觀察到任何的毒副作用。HPPS以仿HDL的合適小納米粒徑、通過(guò)SR-BI受體介導(dǎo)的直接胞漿運(yùn)輸

7、siRNA機(jī)制、良好生物相容性，都使其成為一種非常理想、有潛力的siRNA運(yùn)輸載體；
　　3）多模式成像指導(dǎo)下基于HPPS的RNA干擾治療方案優(yōu)化研究：證實(shí)了HPPS能夠在體全身系統(tǒng)性給藥高效運(yùn)輸及釋放siRNA并且發(fā)揮有效腫瘤抑制效果之后，通過(guò)同時(shí)裝載近紅外熒光探針以及運(yùn)輸siRNA，本研究研發(fā)了一種多功能診療納米載體 HPPS(NIR)-chol-siRNA。在小鼠原位前列腺腫瘤模型上發(fā)現(xiàn)這種載體能夠特異性地靶向PC3腫瘤，并

8、以其在腫瘤中高度選擇性的優(yōu)勢(shì)通過(guò)多模式成像例如CT-FMT無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)地以NIR熒光示蹤siRNA運(yùn)輸過(guò)程，并且實(shí)現(xiàn)活體診斷PC3腫瘤、定量評(píng)估siRNA在腫瘤中的攝取量從而達(dá)到優(yōu)化治療方案提高抗腫瘤療效的目的。
　　綜上所述，本研究中的多功能多肽-脂質(zhì)納米載體可以解決在全身系統(tǒng)性給藥運(yùn)輸siRNA的主要限速因素實(shí)現(xiàn)高效、安全的在體運(yùn)輸，并且滿足在成像指導(dǎo)下的藥物運(yùn)輸以及診斷治療學(xué)這些新型腫瘤研究領(lǐng)域的需求實(shí)現(xiàn)多模式成像指導(dǎo)下的RN