非小細胞肺癌HAb18G的表達與其臨床病理特征、預后及生物學行為關系的研究.pdf

1、研究背景:
　　 肺癌尤其是非小細胞肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤。近50多年來，世界各國特別是工業(yè)發(fā)達國家，肺癌的發(fā)病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。目前，綜合治療方案已使療效有所提高，但肺癌5年生存率仍不足20％，腫瘤的侵襲和轉移是肺癌患者死亡的主要原因，因此探討與腫瘤侵襲和轉移相關分子有著十分重要的意義。
　　 HAb18G是在研究肝癌過程中發(fā)現的一個新的細胞表面黏附分子，經GenBank數

2、據庫查詢，證實為CD147家族新成員，它具有介導細胞黏附、運動、誘導MMPs產生、血管生成、信號轉導、逆轉纖維化、激活糖酵解、抗腫瘤耐藥等許多重要功能和作用。已有文獻報道HAb18G分子在肝癌、乳腺癌、前列腺癌和食管癌高表達提示患者的預后不良。盡管也有學者對CD147在非小細胞肺癌表達和預后做出了分析，但對其是否能作為判斷非小細胞肺癌預后的獨立因素觀點卻不一。那么作為CD147家族新成員，HAb18G與非小細胞肺癌臨床病理特征和預后關系

3、如何？HAb18G除了具有CD147家族分子的一般功能作用，除此之外，有沒有其他新的作用？雖然以往學者也注意到HAb18G表達主要定位于胞膜或胞漿，但是他們忽略了這種不同的定位方式與患者臨床病理特征和預后的關系，且以往對HAb18G在組織中的表達多以定性研究為主，其定量特點如何？這些問題目前尚未見文獻報道，為此我們進行了研究。大量多研究表明MMPs是參與破壞細胞外基質的主要作用者，在腫瘤的侵襲和轉移中發(fā)生了重要作用，而MMP-2、MMP

4、-9是與肺癌發(fā)生發(fā)展關系最為密切的基質金屬蛋白酶。癌細胞的生長、轉移依賴新生血管的形成，血管內皮生長因子(VEGF)是最有效的促血管生長因子。有研究表明在人肝癌細胞中HAb18G/CD147的高表達可以誘導MMPs分泌和活化，在乳腺癌細胞中該基因過表達可以引起MMP-9和VEGF的升高。在肺癌組織中，有研究表明CD147與MMP-2在蛋白水平呈正相關。那么在肺癌細胞中HAb18G與MMP-2、MMP-9和VEGF在mRNA水平是否也遵循

5、相似的規(guī)律？HAb18G作為一種新的基質金屬蛋白酶誘導劑其對肺癌周圍成纖維細胞分泌MMP-2和MMP-9有無影響？此外，HAb18G對肺癌細胞A549生物學行為如遷移、增值和凋亡能力有何影響？這些都是有待探討的問題。
　　 本課題組前期實驗結果表明PTEN（10號染色體丟失的磷酸酶基因及張力蛋白同源物，Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）蛋白表達的缺失

6、與肺癌發(fā)生發(fā)展有一定的關系。那么PTEN與HAb18G在非小細胞肺癌中有無相關關系呢，這也是本課題研究的內容之一。
　　 基于以上分析，本課題主要從定量和半定量角度，結合HAb18G在非小細胞肺癌中的定位情況揭示其在非小細胞肺癌中的表達特點及變化規(guī)律，分析其在非小細胞肺癌中的預后意義，并結合課題組前期實驗分析PTEN和HAb18G在非小細胞肺癌組織中的表達規(guī)律并探討二者相互關系。此外，我們利用RNA干擾技術，探討HAb18G與M

7、MPs和VEGF的關系，從細胞水平進一步探討HAb18G對肺癌細胞遷移、增值、凋亡的影響。
　　 目的:
　　 1.結合HAb18G在非小細胞肺癌中的定位情況，定量分析其在非小細胞肺癌中表達特點及變化規(guī)律，并分析其在非小細胞肺癌預后中的意義;
　　 2.結合課題組前期實驗結果分析PTEN與HAb18G在非小細胞肺癌中的相關關系;
　　 3.初步探討HAb18G對其下游基因MMP-2、MMP-9及VEGF的

8、影響;初步探討HAb18G對肺癌細胞A549和成纖維細胞共培養(yǎng)的影響;
　　 4.初步探討HAb18G對肺癌細胞A549遷移、增值和凋亡能力的影響。
　　 材料和方法:
　　 1.HAb18G在正常肺組織、非良性病變及非小細胞肺癌中的定量表達特點及其與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關系
　　 用免疫組織化學SP方法檢測HAb18G蛋白在41例相對正常成人肺組織、19例肺部良性病變和208例非小細胞肺癌的表

9、達，用Imageproplus圖像分析技術測試HAb18G蛋白的陽性單位(Positive Unit，PU)，分析不同類型肺組織中HAb18G蛋白表達強度的變化規(guī)律，及其表達高低水平和不同定位情況分別與非小細胞肺癌臨床病理特征之間的關系。
　　 2.半定量結果的判斷
　　 采用半定量判斷對有隨訪資料的136例病人進行生存分析。根據染色程度和染色細胞所占百分比進行評分，半定量判定:陰性（無陽性著色）或弱陽性（+或者++，細

10、胞著色范圍＜30％）判斷為低表達;中等強度陽性（++，細胞著色范圍≧30％或者+++，細胞著色范圍＜50％）或者強陽性(+++，細胞著色范圍＞50％)判斷為高表達。
　　 3.應用實時熒光定量PCR(quantitive real time PCR，qRT-PCR)方法、免疫組化檢測肺癌細胞HAb18G的表達情況，選擇表達較高者進行RNA干擾。
　　 4.用qRT-PCR和Western blot檢測SiRNA干擾HAb

11、18G后其下游基因MMP-2、MMP-9和VEGF的變化。
　　 5.用qRT-PCR檢測肺癌細胞A549與成纖維細胞共培養(yǎng)后MMP-2和MMP-9的變化。
　　 6.劃痕實驗、MTT增值實驗和TUNEL凋亡實驗檢測HAb18G對肺癌細胞生物學行為的影響。
　　 7.統計分析
　　 用SPSS13.0軟件進行統計學分析。兩樣本均數間的比較采用獨立樣本t檢驗，配對樣本均數間的比較采用配對樣本t檢驗。多樣本均

12、數間的比較采用方差分析，若方差齊，組間多重比較采用LSD;若方差不齊，組間的多重比較采用Dunnett's T3檢驗。非雙變量正態(tài)分布資料的相關分析采用Spearman相關系數法。五年生存率的比較采用Pearson x2檢驗，用Kaplan-Meier法進行單因素生存分析，差異顯著性檢驗采用log rank檢驗，多因素生存分析采用Cox風險比例模型方法分析。
　　 結果:
　　 一、HAb18G蛋白在非小細胞肺癌中的表達

13、情況
　　 HAb18G在非小細胞肺癌組織中的表達主要定位于肺癌細胞膜或漿，為粗細不等的棕褐色顆粒，其在肺鱗癌角化珠中低表達或不表達;其在正常肺組織及肺良性病變中幾乎不表達，在支氣管擴張的粘膜上皮細胞及管壁腺體上皮細胞中有少量表達。在208非小細胞肺癌患者中，35例低表達(16.8％)，173例高表達(83.2％);94例膜表達為主(45.2％)，包括51例鱗癌，33例腺癌，10例大細胞癌;81例漿表達為主(51.0％)，包括3

14、9例鱗癌，62例腺癌和5例大細胞癌;8(3.8％)例無陽性著色，包括7例腺癌和1例大細胞癌。
　　 非小細胞肺癌組織中HAb18G的PU值高于正常肺組織和肺良性病變中的PU值（t=-25.34，P=0.000）;正常肺組織和肺良性病變中的PU值基本相同（t=-1.43，P=0.158）;在208例不同組織類型的非小細胞肺癌中，PU值存在差異（F=8.51，P=0.000），其中肺鱗癌PU值大于肺腺癌(P=0.000)，肺鱗癌和肺

15、大細胞癌、肺腺癌和肺大細胞癌中HAb18G蛋白PU值基本相同，差異均無統計學意義(P=0.407和P=0.171)。
　　 在200例有著色的HAb18G蛋白定位情況中，膜表達的HAb18G蛋白PU值高于漿表達的PU值(t=8.76，P=0.000)。在膜表達組別中，不同類型的非小細胞肺癌組織中PU值存在差異（F=4.08，P=0.02），其中鱗癌的PU值分別高于腺癌和大細胞癌的PU值（P=0.025和P=0.027），腺癌和大

16、細胞癌的PU值無顯著性差異（P=0.464）;在漿表達組別中，鱗癌，腺癌和大細胞癌PU值無顯著性差異（F=5.23，P=0.085）。
　　 二、HAb18G在不同腺癌亞型中表達情況
　　 HAb18GPU值與不同的肺腺癌亞型有關（F=34.45，P=0.000），其在在貼壁為主型、乳頭為主型、腺泡為主型、微乳頭型、實體為主伴粘液形成型腺癌中表達依次升高。
　　 三、HAb18G表達水平和定位情況與非小細胞肺癌患

17、者臨床病理特征的關系
　　 在該蛋白表達水平方面，中至低分化肺鱗癌和肺腺癌癌HAb18G蛋白PU值明顯高于高分化癌，差異具有統計學意義（t=-5.26，P=0.000）;肺癌TNM分期Ⅰ期、Ⅱ-Ⅲ期、Ⅳ期HAb18G蛋白PU值依次升高，兩兩比較差異具有統計學意義(F=22.47，P=0.000);有淋巴結轉移的肺癌原發(fā)灶中HAb18G蛋白的PU值高于無淋巴結轉移的原發(fā)灶，差異有統計學意義（t=-2.45，P=0.015）;原發(fā)灶

18、HAb18G蛋白PU值與相應轉移灶基本相同，差異無統計學意義(t=-0.34，P=0.74);該蛋白有遠處轉移的原發(fā)灶表達水平大于無遠處轉移之原發(fā)灶(t=-5.58，P=0.000);男性患者HAb18G PU值的水平高于女性患者(t=2.21，P=0.028);腫瘤最大直徑＞5cm的肺癌組織PU值大于腫瘤最大直徑≦5cm的肺癌組織(t=-4.44，P=0.000);有吸煙史的患者高于無吸煙史的患者(t=-2.71，P=0.007);中

19、央型肺癌高于周圍型（t=3.88，P=0.000）。HAb18G PU值與非小細胞肺癌患者年齡無關（t=1.08, P=0.280）。
　　 200例有著色的HAb18G蛋白定位情況與臨床病理特征關系的分析結果顯示，膜表達組別中，HAb18GPU值與分化程度有關(t=-3.26，P=0.002);胞漿和胞膜的表達水平均與腫瘤的分期（分別t=5.79，P=0.004; t=7.72，P=0.000）和遠處是否轉移有關（分別t=-2

20、.71，P=0.014; t=-3.46，P=0.001）。該蛋白的定位均與患者的其他臨床病理特征無關（P＞0.05）。
　　 四、HAb18G表達水平和定位情況與非小細胞肺癌患者預后的關系
　　 本研究中136例非小細胞肺癌患者的5年總體生存率為30.9％(42/136)。HAb18G低表達和高表達的五年生存率分別為75％(18/24)和21.4％(24/112)(x2=26.57，P=0.000)。Kaplan-Me

21、ier分析結果顯示136例非小細胞肺癌中HAb18G高表達患者的總體生存情況顯著低于HAb18G低表達患者（P=0.000，log rank檢驗）。HAb18G在鱗癌和腺癌中表達越高，患者的生存時間也越短（分別P=0.001，P=0.003，log rank檢驗）。在TNMⅠ和TNMⅡ-Ⅲ，HAb18G表達越高，提示患者預后越差（分別P=0.001，P=0.01，log rank檢驗）。
　　 HAb18G在無著色組、漿定位、膜

22、定位組別中，患者五年生存率分別為85.7％(6/7),45.2％(33/73)和5.4％(3/56)，三組比較差異具有統計學意義(x2=33.97，P=0.000)。Kaplan-Meier分析結果顯示136例非小細胞肺癌中HAb18G胞膜表達患者的總體生存時間顯著低于胞漿表達（P=0.000，log rank檢驗）。此外，無論是鱗癌還是肺腺癌中，HAb18G胞膜表達患者的總體生存時間均顯著低于胞漿表達的總體生存時間（分別P=0.000

23、，P=0.004，log rank檢驗）。
　　 五、Cox風險比例模型多因素分析
　　 將患者年齡、性別、吸煙史、腫瘤大小、大體類型、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期、HAb18G的表達及定位全變量做Cox模型多因素分析，結果表明淋巴結轉移、遠處轉移、HAb18G表達和定位情況是均是影響總體生存時間的獨立預后因素（分別P=0.019，P=0.000，P=0.000，P=0.003）。最終選擇的四個變量模型結果

24、提示淋巴結轉移、遠處轉移、HAb18G表達和定位情況是均是影響患者總生存期的獨立預后因素（分別P=0.012，P=0.000，P=0.000, P=0.001）。
　　 六、HAb18G受試者工作特征曲線(ROC)
　　 HAb18G的ROC曲線的面積為0.989，HAb18G蛋白PU值用于區(qū)別非小細胞肺癌與非肺癌肺組織有顯著性意義（P=0.000）。
　　 七、PTEN和HAb18G在非小細胞肺癌組織中的表達及

25、其相關性分析
　　 PTEN蛋白在非小細胞肺癌組織中表達的陽性強度明顯低于肺部良性病變和正常肺組織（t=4.67，P=0.000），其表達水平與組織分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均無關（P＞0.05），周圍型大于中央型（t=2.46，P=0.016）。HAb18G蛋白在非小細胞肺癌組織中表達的陽性強度明顯高于肺良性病變和正常肺組織(t=-17.37, P=0.000)，其表達水平與非小細胞肺癌分化程度、淋巴結轉移及TNM分期均

26、有關（P＜0.05）。不同類型的肺組織中PTEN和HAb18G蛋白表達之間呈負相關（r=-0.312，P=0.002）。
　　 八、HAb18G對腫瘤細胞本身分泌MMP-2、MMP-9和VEGF的影響
　　 與空白對照組相比，qRT-PCR結果顯示，HAb18G SiRNA干擾48小時后其mRNA下降了94％（t=-92.96，P=0.000），空白對照組、空脂質體組和無關序列組其HAb18G mRNA水平無顯著性差異（

27、F=0.511，P=0.610）;MMP-2 mRNA水平較對照組下降約62％（t=-10.92，P=0.000）;MMP-9mRNA水平較對照組下降70％（t=-7.27, P=0.000）;VEGF mRNA水平較對照組下降約94％（t=-45.32, P=0.000）。Western blot結果顯示SiRNA干擾48h后，HAb18G蛋白水平較對照組下降40％（t=58.55, P=0.000），MMP-2蛋白水平較對照組下降3

28、4％(t=27.23，P=0.000)MMP-9蛋白水平較對照組下降31％（t=28.64，P=0.000），VEGF蛋白水平較對照組下降35％(t=27.25，P=0.000)。
　　 九、HAb18G對肺癌細胞和成纖維細胞共培養(yǎng)后的影響
　　 對照組A549細胞和SiHAb18G A549細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)后所分泌的MMP-2分別較單獨培養(yǎng)時增高56％(t=-174.20，P=0.000)和77.36％(t=-4

29、26.03，P=0.000);對照組A549細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)后較SiHAb18G A549細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)所分泌的MMP-2增高約57％(t=-178.16，P=0.000);對照組A549細胞和SiHAb18G A549細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)后所分泌的MMP-9分別較單獨培養(yǎng)時增高79％（t=-199.16，P=0.000）和91.67％（t=-311.81，P=0.000）;對照組A549細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)后較SiH

30、Ab18G A549細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)所分泌的MMP-9增高約40％(t=-71.39，P=0.000)。
　　 十、HAb18G對肺癌細胞遷移、增值和凋亡能力的影響
　　 在劃痕后的第0h-48h動態(tài)記錄觀察不同處理組A549細胞的遷移情況，24h結果顯示，與陰性對照組相比，干擾組的A549細胞遷移距離和數量開始下降。與對照組相比，48h后干擾組的A549細胞遷移距離和數量開始明顯下降，干擾組遷移距離小于無關序列對

31、照組（t=11.39，P=0.000），干擾組細胞遷移數目小于無關序列對照組（t=36.22，P=0.000）。
　　 MTT結果顯示，干擾組A549細胞增殖能力在24h、48h和72h較空白對照組分別下降了40.15％，44.32％，42.52％(P＜0.05)，干擾組A549細胞增殖能力在24h、48h和72h較陰性對照組分別下降了41.00％，43.72％，41.98％(P＜0.05)。空白對照組和無關序列組增殖能力均基本

32、相同（P＞0.05）。Ki67蛋白水平在干擾組中也顯著下降（t=17.14.P=0.000）。
　　 Tunel凋亡實驗顯示，與對照組相比，干擾組細胞凋亡數目顯著增多，對兩組凋亡圖片進行圖像分析，干擾組凋亡強度，即光密度OD值顯著高于對照組凋亡強度（t=-8.85，P=0.000）。
　　 結論:
　　 1.HAb18G表達水平與非小細胞肺癌患者的性別、吸煙史、腫瘤直徑大小、分化、分期、淋巴結轉移和遠處轉移有關，

33、其表達水平越高，患者的預后越差。膜定位的HAb18G表達與分化有關;膜定位和漿定位的HAb18G表達均與TNM分期和遠處轉移有關;HAb18G細胞膜表達提示患者預后較差。Cox多因素回歸模型分析顯示淋巴結轉移狀況、遠處轉移狀況、HAb18G表達水平和細胞定位是影響患者生存的獨立預后因素。ROC曲線提示HAb18G蛋白PU值用于診斷非小細胞肺癌有較高的價值。
　　 2.HAb18G與PTEN呈負相關，PTEN的低表達或缺失，可能與