褪黑素抑制脂多糖誘導(dǎo)的大鼠肝臟星狀細(xì)胞增殖作用的研究.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)采用原位膠原酶灌注法和梯度密度離心法,從SD大鼠肝臟分離HSC.培養(yǎng)10—14天后傳代,貼片法及ABC法作免疫組織化學(xué)染色鑒定,大鼠結(jié)蛋白(Desmin)表達(dá)陽性率純度為95％以上,平滑肌肌動(dòng)蛋白α-SMA則幾達(dá)100％.由于脂多糖比較全面的激活能力,能夠以依賴和不依賴NO的方式激活HSC,傳代的HSC給予低血清(5％胎牛血清)培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí),使其靜止后,分別采用終濃度為1ng/mL,10ng/mL,100ng/mL的脂多糖刺

2、激HSC,MTT法檢測(cè)其生存能力.為了解MLT誘導(dǎo)HSC凋亡是否與caspase有關(guān),利用酶特異的可見光底物DEVD-pNA與caspase3作用后顯色的原理,用分光光度計(jì)檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度.HSCs激活、增殖,往往伴隨著NF-κB的持續(xù)升高.最近對(duì)HSC的研究表明,NF-κB是保護(hù)性因素,抑制細(xì)胞的凋亡.我們采用Western blot檢測(cè)MLT對(duì)NF-κBp65的表達(dá)影響,結(jié)果,小劑量LPS的刺激下,HSCs激活、增殖,檢測(cè)出高表達(dá)

3、的NF-κB,0.1mmol/L的MLT顯著的抑制了NF-κB的表達(dá),P<0.01.氧化應(yīng)激是肝損傷和肝纖維化之間的重要關(guān)聯(lián),氧化應(yīng)激可通過誘導(dǎo)NF-κB活性,在HSC的激活中起重要作用.該實(shí)驗(yàn)采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)DCFH-DA轉(zhuǎn)化為DCF的熒光強(qiáng)度,代表細(xì)胞內(nèi)ROS水平.該實(shí)驗(yàn)還采用放射免疫法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度,免疫熒光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度.結(jié)果發(fā)現(xiàn),預(yù)先給予0.1mmol/LMLT組細(xì)胞內(nèi)cAMP水平和鈣離子濃度顯著低于對(duì)