動(dòng)態(tài)觀察丹參酮ⅡA對(duì)血小板活化鈣信號(hào)的影響.pdf

1、目的：利用細(xì)胞成像技術(shù)實(shí)時(shí)記錄外源性血小板膜受體激動(dòng)劑作用于相應(yīng)的膜受體時(shí)胞內(nèi)鈣離子水平動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，觀察丹參酮ⅡA（TSN）對(duì)血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，探討TSN抗血小板活化鈣信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：有效分離富集血小板血漿和非活化血小板，體外觀察不同濃度TSN對(duì)血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。非活化血小板在37℃下孵育10 min，加入血小板激動(dòng)劑二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)劑

2、（IMC），在電磁攪拌下記錄5 min內(nèi)血小板聚集過(guò)程。用鈣信號(hào)指示劑fura-2/AM孵育標(biāo)記血小板，以波長(zhǎng)為340、380 nm的紫外光交替激發(fā)，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm的發(fā)射光由EM-CCD相機(jī)捕獲，圖像用Andor iQ2圖像分析軟件處理，主要分析340/380的熒光比值（340/380 ratio）變化量，測(cè)定不同濃度TSN作用前后血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的變化、熒光比值達(dá)峰時(shí)間等。
　　結(jié)果：
　　1.血小板聚集率測(cè)定

3、:不同濃度的TSN對(duì)ADP、ATP引發(fā)的血小板最大聚集率與陰性對(duì)照組比較具有顯著性差異有明顯的抑制作用（0.5μM TSN組除外）；在TSN各濃度組中，2μM TSN組抑制效果最明顯，與其余各實(shí)驗(yàn)組比較均有顯著性差異；0.5μM TSN組抑制效果最弱，與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異；1μM TSN組、4μM TSN組組間抑制效果統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異。
　　2.血小板胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定
　　2.1血小板活力觀察：明場(chǎng)觀察下，陽(yáng)性對(duì)照

4、組活化的血小板呈現(xiàn)碎片狀，無(wú)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，無(wú)法辨認(rèn)血小板胞體，無(wú)偽足；TSN組未活化的血小板有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，血小板胞體類圓形，清晰可見，無(wú)偽足。熒光觀察下，陰性對(duì)照組活化血小板中心高亮區(qū)為血小板胞體，周邊絲狀物為血小板活化后變形伸出的偽足；TSN組活化血小板較陰性對(duì)照組血小板胞體中心高亮區(qū)暗，偽足較短；陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)熒光發(fā)出。
　　2.2血小板活化鈣信號(hào)測(cè)定：在測(cè)試液含鈣情況下，ADP、ATP、IMC均能誘導(dǎo)血小板活化，胞內(nèi)鈣離

5、子濃度顯著升高。TSN各個(gè)劑量組對(duì)血小板活化峰值變化量（鈣離子濃度）和達(dá)峰時(shí)間均有抑制作用（0.5μM TSN組除外），其中2μM TSN組抑制效果最明顯，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.5μM TSN組與陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用無(wú)鈣測(cè)試液，其測(cè)定結(jié)果與使用含鈣測(cè)試液的結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1、TSN能夠抑制由ADP、ATP等誘發(fā)的血小板聚集；
　　2、TSN能夠抑制血小板的自發(fā)活化，維持血小板的活性及結(jié)構(gòu)完