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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:利用細(xì)胞成像技術(shù)實(shí)時(shí)記錄外源性血小板膜受體激動(dòng)劑作用于相應(yīng)的膜受體時(shí)胞內(nèi)鈣離子水平動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,觀察丹參酮ⅡA(TSN)對(duì)血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的影響,探討TSN抗血小板活化鈣信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制,為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:有效分離富集血小板血漿和非活化血小板,體外觀察不同濃度TSN對(duì)血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。非活化血小板在37℃下孵育10 min,加入血小板激動(dòng)劑二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)劑
2、(IMC),在電磁攪拌下記錄5 min內(nèi)血小板聚集過(guò)程。用鈣信號(hào)指示劑fura-2/AM孵育標(biāo)記血小板,以波長(zhǎng)為340、380 nm的紫外光交替激發(fā),發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm的發(fā)射光由EM-CCD相機(jī)捕獲,圖像用Andor iQ2圖像分析軟件處理,主要分析340/380的熒光比值(340/380 ratio)變化量,測(cè)定不同濃度TSN作用前后血小板胞內(nèi)鈣離子濃度的變化、熒光比值達(dá)峰時(shí)間等。
結(jié)果:
1.血小板聚集率測(cè)定
3、:不同濃度的TSN對(duì)ADP、ATP引發(fā)的血小板最大聚集率與陰性對(duì)照組比較具有顯著性差異有明顯的抑制作用(0.5μM TSN組除外);在TSN各濃度組中,2μM TSN組抑制效果最明顯,與其余各實(shí)驗(yàn)組比較均有顯著性差異;0.5μM TSN組抑制效果最弱,與陰性對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異;1μM TSN組、4μM TSN組組間抑制效果統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異。
2.血小板胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定
2.1血小板活力觀察:明場(chǎng)觀察下,陽(yáng)性對(duì)照
4、組活化的血小板呈現(xiàn)碎片狀,無(wú)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),無(wú)法辨認(rèn)血小板胞體,無(wú)偽足;TSN組未活化的血小板有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu),血小板胞體類圓形,清晰可見,無(wú)偽足。熒光觀察下,陰性對(duì)照組活化血小板中心高亮區(qū)為血小板胞體,周邊絲狀物為血小板活化后變形伸出的偽足;TSN組活化血小板較陰性對(duì)照組血小板胞體中心高亮區(qū)暗,偽足較短;陽(yáng)性對(duì)照組無(wú)熒光發(fā)出。
2.2血小板活化鈣信號(hào)測(cè)定:在測(cè)試液含鈣情況下,ADP、ATP、IMC均能誘導(dǎo)血小板活化,胞內(nèi)鈣離
5、子濃度顯著升高。TSN各個(gè)劑量組對(duì)血小板活化峰值變化量(鈣離子濃度)和達(dá)峰時(shí)間均有抑制作用(0.5μM TSN組除外),其中2μM TSN組抑制效果最明顯,組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.5μM TSN組與陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用無(wú)鈣測(cè)試液,其測(cè)定結(jié)果與使用含鈣測(cè)試液的結(jié)果一致。
結(jié)論:
1、TSN能夠抑制由ADP、ATP等誘發(fā)的血小板聚集;
2、TSN能夠抑制血小板的自發(fā)活化,維持血小板的活性及結(jié)構(gòu)完
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