逼尿肌不穩(wěn)定粘連連接超微結(jié)構(gòu)變化的免疫組化監(jiān)測和電鏡觀察.pdf

1、目的：采用免疫組織化學方法及電鏡技術(shù)研究偶聯(lián)膀胱平滑肌細胞的粘連連接蛋白質(zhì)構(gòu)成，通過觀察粘連連接主要構(gòu)成蛋白成分在下尿路梗阻并發(fā)膀胱過度活動患者中的變化，探討人逼尿肌粘連連接在膀胱不穩(wěn)定患者中的數(shù)量改變，進而分析粘連連接與膀胱過度活動之間的關(guān)系。揭示下尿路梗阻患者出現(xiàn)膀胱過度活動的肌源性發(fā)病機制，為臨床提供參考。 方法：隨機選取經(jīng)尿動力學檢查證實為逼尿肌不穩(wěn)定(detrusorinstability，DI)的BPH住院患者35例

2、，為實驗組，年齡62-87歲，平均69.1歲；非梗阻性逼尿肌(取自膀胱癌患者)9例作為對照組，年齡57-80歲，平均66.3歲。均排除其它相關(guān)疾病。術(shù)前經(jīng)過IPSS評分。在擇期開放手術(shù)過程中獲得逼尿肌組織，并征得所有患者的書面同意(經(jīng)院倫理委員會同意)。用手術(shù)刀從膀胱前壁切取膀胱壁全層組織(約0.5×0.5×1.0cm大小)，避免組織破壞和電烙造成假象。每個離體標本被立即分為兩份，一份約0.5 cm×0.5 cm大小，在1分鐘內(nèi)被切割成

3、約0.1 cm×0.1 cm的肌條存放入2﹪戊二醛中溶液中，用于電鏡觀察；另一份標本約0.5×0.5 cm大小，存放入10﹪的福爾馬林中性溶液中保存。人膀胱上皮作為內(nèi)部陽性對照，人正常闌尾組織、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌組織作為已知的外部陽性對照。 標本固定好，將組織塊分別進行縱切與橫切，石蠟包埋，連續(xù)4μm切片，HE染色及用多克隆P-鈣粘蛋白抗體，單克隆α、β、和γ-連環(huán)蛋白抗體檢測，所有抗體都與粘連連接蛋白發(fā)生反應。 電鏡

4、觀察實驗組和對照組逼尿肌細胞連接的超微結(jié)構(gòu)。免疫組織化學方法測定各組標本中鈣粘蛋白、α-、β-、γ-連環(huán)蛋白的表達變化，每一逼尿肌至少評價切面上10個視野，計數(shù)可見粘連連接數(shù)量，并用計算機圖像分析系統(tǒng)對膀胱逼尿肌粘連連接構(gòu)成蛋白的含量進行半定量分析，分別計算出每個樣本中鈣粘蛋白、α-、β-、γ-連環(huán)蛋白的平均含量。分別進行以下比較： (1) 實驗組與對照組平滑肌中粘連連接構(gòu)成蛋白的含量； (2) 穩(wěn)定膀胱逼尿肌與伴有膀

5、胱過度活動逼尿肌中粘連連接的數(shù)量； (3) 實驗組平滑肌粘連連接各構(gòu)成蛋白量的變化： 結(jié)果： 1.經(jīng)免疫組織化學染色后光學顯微鏡觀察并經(jīng)計算機圖像分析系統(tǒng)進行半定量測定(1)在非梗阻及伴有膀胱過度活動的逼尿肌中均檢測到鈣粘蛋白、及α、β、和γ-連環(huán)蛋白的特異性染色；并且檢測到平滑肌細胞間粘連連接的特異性染色。 (2)實驗組(DI)平滑肌切片中P-鈣粘蛋白和α、β、和γ-連環(huán)蛋白著色較淺并且不均勻，分布

6、不規(guī)則。逼尿肌細胞間粘連連接明顯減少，著色淺，周圍見較多雜亂纖維。對照組中非梗阻逼尿肌切片著色較深并且分布均勻，見大量特異性濃染的P-鈣粘蛋白和α、β、和γ-連環(huán)蛋白，肌細胞排列規(guī)則，細胞間大量粘連連接，連接著色較深，肌細胞形態(tài)規(guī)則，連接集中。實驗組粘連連接蛋白的數(shù)量與對照組相比明顯減少(P<0.0 1)。 (3)實驗組和對照組粘連連接的數(shù)量低于各組內(nèi)膀胱上皮粘連連接的數(shù)量(P<0.01)。 2.在電鏡下觀察(1) 實

7、驗組(DI)肌纖維排列不整齊，肌細胞分布不均勻，肌膜周圍有高電子密度物質(zhì)堆積，細胞間以胞突連接及縫隙連接(gapjunction，GP)為主：細胞間隙明顯增寬，可見大量膠原纖維；平滑肌細胞間連接明顯減少或消失，逼尿肌細胞出現(xiàn)肥大，線粒體腫脹、破裂； (2) 對照組平滑肌纖維排列整齊，肌細胞分布均勻，肌細胞間隙細胞之間連接以粘連連接(adherens junction，AJ)為主，細胞間的彈性纖維和膠原纖維含量較少，逼尿肌細胞內(nèi)