云芝糖肽及其復(fù)方的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的：1.建立艾氏腹水癌實(shí)體型荷瘤小鼠動(dòng)物模型，觀察云芝糖肽分別與丹參酮ⅡA、黃芪多糖聯(lián)合使用后的治療效果，以此來檢測(cè)并驗(yàn)證云芝糖肽及其復(fù)方的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用；2.對(duì)云芝糖肽的有效作用組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定，并以淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)來驗(yàn)證其免疫調(diào)節(jié)作用；3.建立人淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，應(yīng)用基因芯片及RT-PCR的方法探討云芝糖肽有效作用組分對(duì)其免疫調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，分析其作用機(jī)制，為優(yōu)化云芝糖肽為基礎(chǔ)的中藥組方、大幅度

2、提高臨床療效提供知識(shí)基礎(chǔ)準(zhǔn)備。 方法：1.建立艾氏腹水癌(EAC)實(shí)體型荷瘤小鼠動(dòng)物模型，隨機(jī)分為9組：生理鹽水對(duì)照組(NS)、阿霉素處理組(ADM)、云芝糖肽組(PSP)、丹參酮IIA組(TanⅡA)、黃芪多糖組(APS)、云芝丹參復(fù)方組(PSP+TanⅡA)、云芝黃芪復(fù)方組(PSP+APS)、綜合治療組Ⅰ(ADM+PSP+TanⅡA)和綜合治療組Ⅱ(ADM+PSP+APS)。阿霉素組和綜合組小鼠連續(xù)3 d腹腔注射阿霉素，生理

3、鹽水、云芝糖肽、丹參酮ⅡA及黃芪多糖均以一定濃度連續(xù)灌胃給藥。30 d后，眼球取血EDTA-Na2抗凝，以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)小鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群(CD3、CD4、CD8)的變化；再斷頸椎處死小鼠，分別取小鼠EAC實(shí)體瘤、脾臟、胸腺等組織，稱量并計(jì)算抑瘤率、臟器指數(shù)的變化，以免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)脾臟中IL-2、IL-2R，以及瘤組織中CDK4、Bax、Bcl-2的表達(dá)情況，來評(píng)價(jià)云芝糖肽及云芝丹參復(fù)方、云芝黃芪復(fù)方的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的

4、作用，并初步分析其作用機(jī)制；2.應(yīng)用水煮醇沉法對(duì)云芝糖肽粗粉進(jìn)行再提取，應(yīng)用苯酚硫酸法和考馬斯亮監(jiān)法監(jiān)測(cè)多糖和蛋白含量變化，應(yīng)用葡聚糖凝膠過濾、紙層析、SDS-PAGE電泳、紫外光譜、紅外掃描等對(duì)云芝糖肽的純度、結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，然而最后得到的中性云芝糖肽制品(N-PSP-F)是否仍具有藥效活性呢?我們應(yīng)用淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化試驗(yàn)對(duì)其免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了驗(yàn)證分析；3.應(yīng)用基因芯片分析并篩選N-PSP-F調(diào)節(jié)體外原代培養(yǎng)淋巴細(xì)胞增殖活化過程中信

5、號(hào)傳導(dǎo)及效應(yīng)因子的變化情況，并以RT-PCR法驗(yàn)證Toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中n,R4、MyD88、IL-6水平的變化，以GAPDH作為內(nèi)參，對(duì)云芝糖肽具體的信號(hào)途徑進(jìn)行初步探索。 結(jié)果：1.云芝糖肽組方I動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果淋巴細(xì)胞亞群：和NS對(duì)照組相比，PSP能顯著增加小鼠外周血CD3+T淋巴細(xì)胞百分率和CD4+/CD8+比值(P＜0.05)；TanIIA能顯著增加CD4+/CD8+比值(P＜0.05)；PSP+TanIIA不但使小

6、鼠外周血CD3+T淋巴細(xì)胞百分率和CD4+/CD8+比值顯著增加，還能增加CD4+T淋巴細(xì)胞百分率(P＜0.05)；而陽性化療藥物ADM卻導(dǎo)致小鼠外周血CD3+T淋巴細(xì)胞百分率明顯降低(P＜0.05)；并且還發(fā)現(xiàn)PSP+TanⅡA能明顯改善ADM導(dǎo)致的小鼠外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分率的降低(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果：與NS對(duì)照組相比，PSP能顯著增加小鼠脾臟IL-2、IL-2R的表達(dá)水平，卻使得實(shí)體瘤組織中CDK4、Bc

7、l-2的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；TanⅡA能使實(shí)體瘤組織中CDK4表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；PSP+TanⅡA在降低實(shí)體瘤組織中CDK4、Bcl-2表達(dá)水平的同時(shí)，還能使其中Bax的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)；此外，還發(fā)現(xiàn)ADM+PSP+TanⅡA亦可以明顯降低實(shí)體瘤CDK4表達(dá)水平，同時(shí)增加Bax的表達(dá)水平(P＜0.05)。2.云芝糖肽組方Ⅱ動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果淋巴細(xì)胞亞群：與NS對(duì)照組相比，云芝糖肽和云芝黃芪復(fù)方均能

8、顯著增加小鼠外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分率和CD4+/CD8+的比值(P＜0.05)，CD8+T細(xì)胞的百分率較阿霉素化療組顯著降低(P＜0.05)；黃芪多糖組雖也使淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生改變，但結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)差異均無顯著性；并且還發(fā)現(xiàn)云芝黃芪復(fù)方可顯著抑制阿霉素導(dǎo)致的小鼠外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分率的降低(P＜0.05)。免疫組化結(jié)果：與NS對(duì)照組比較，云芝糖肽和云芝黃芪復(fù)方能促使小鼠的脾臟IL-2、IL-2R以及實(shí)體瘤中B

9、ax表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05)，腫瘤bcl-2、CDK4表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；黃芪多糖能顯著降低小鼠實(shí)體瘤中CDK4的表達(dá)水平(P＜0.05)；綜合治療組二能顯著降低腫瘤CDK4和Bcl-2的表達(dá)，并且和阿霉素化療組比較，可以顯著增加脾臟IL-2、IL-2R和腫瘤Bax表達(dá)水平(P＜0.05)，顯著降低腫瘤周期蛋白CDK4的表達(dá)水平(P＜0.05)。3.云芝糖肽藥效成分的分離純化云芝糖肽粗粉經(jīng)再提取純化后為單一組分，多

10、糖含量提高36.22％，蛋白含量提高4.62％，在無水乙醇濃度為60％時(shí)，云芝糖肽沉淀量最大，且云芝糖肽中多糖以中性為主，為蛋白結(jié)合多糖，N-PSP-F在6.25～25 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)仍可與PHA有效協(xié)同刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外發(fā)生增殖反應(yīng)，有利于改善機(jī)體的免疫功能。4.云芝糖肽免疫調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的初步研究Toll樣蛋白受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因芯片(117 spot)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)12，5 μg/mL的云芝糖肽作用于健康成人PBMC

11、后，上調(diào)≥2倍的基因有22個(gè)，占18.8％(如γ-干擾素、干擾素γ-誘導(dǎo)蛋白-10等)，下調(diào)≥2倍的基因有23項(xiàng)，占1 9.7％(如Toll作用蛋白、共刺激分子CD86等)；RI-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)N-PSP-F調(diào)節(jié)人PBMC增殖活化過程中，MyD88基因在中濃度時(shí)首先升高，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平逐漸趨于正常，IL-6基因從24h開始增加，一直延續(xù)到72h；TLR4基因在72h，N-PSP-F為中高濃度時(shí)才顯著增加。 結(jié)論

12、：1.云芝糖肽可通過增強(qiáng)EAC實(shí)體型荷瘤小鼠的免疫功能，從而間接發(fā)揮其抗腫瘤作用，亦可通過調(diào)控瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白CDK4以及改變凋亡蛋白Bax/抗凋亡蛋白Bcl-2的比值，從而直接抑制瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；TanIIA只對(duì)荷瘤小鼠的淋巴細(xì)胞比值有一定影響，但是若和PSP聯(lián)合使用則具有改善淋巴細(xì)胞功能的作用，可增強(qiáng)PSP的免疫調(diào)節(jié)及其抗腫瘤的作用，然而PSP與PSP+TanIIA之間無顯著性差異。2.黃芪多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用，然而其免疫調(diào)節(jié)效果

13、不如云芝糖肽顯著，黃芪多糖還可以影響瘤細(xì)胞的周期蛋白CDK4的表達(dá)，然而其對(duì)瘤細(xì)胞的相關(guān)凋亡蛋白幾無影響。云芝糖肽和云芝黃芪復(fù)方對(duì)EAC實(shí)體型荷瘤小鼠及經(jīng)化療后的荷瘤小鼠均具有免疫增強(qiáng)作用，抗腫瘤療效亦顯著，可見黃芪多糖和云芝糖肽之間無拮抗作用，可能為相加或協(xié)同作用，然而PSP和PSP+APS之間亦無顯著性差異。3.N-PSP-F為溶于水不溶于醇的蛋白結(jié)合多糖類物質(zhì)，其多糖以中性為主，具有吡喃糖環(huán)特征吸收峰，含半乳吡哺糖，具免疫增強(qiáng)作用