柑橘珠心胚起始相關(guān)miRNA挖掘與csi-miR156a調(diào)控體細(xì)胞胚發(fā)生作用機(jī)理.pdf

1、柑橘是世界上廣泛栽培且具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重要果樹(shù)。其常規(guī)雜交育種因受到珠心胚等因素干擾導(dǎo)致進(jìn)程緩慢、效率不高;同時(shí)，珠心胚因含有母本全部遺傳信息而具有固定優(yōu)良性狀的潛能。因此，珠心胚發(fā)生的分子機(jī)理研究將為柑橘育種提供重要理論依據(jù)。microRNA（miRNA）是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一類重要調(diào)控因子。本研究通過(guò)比較柑橘單胚與多胚品種胚珠miRNA表達(dá)水平差異，鑒定可能與珠心胚發(fā)生相關(guān)的miRNA，為深入探討miRNA介導(dǎo)調(diào)控珠心胚起始的內(nèi)

2、在機(jī)制奠定基礎(chǔ)。另一方面，生物技術(shù)也是柑橘育種的重要途徑，體細(xì)胞胚發(fā)生是獲得離體再生植株的常見(jiàn)方式，是柑橘離體種質(zhì)保存與生物技術(shù)育種的重要環(huán)節(jié);柑橘多數(shù)品種的愈傷組織體胚發(fā)生能力隨繼代時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸減弱甚至喪失，一定程度上限制了柑橘生物技術(shù)與遺傳改良研究的開(kāi)展。基于前入研究基礎(chǔ)，本研究以高度保守的miR156為候選關(guān)鍵miRNA，對(duì)其在柑橘體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的潛在功能及相關(guān)調(diào)控機(jī)制展開(kāi)深入分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.小RNA

3、高通量測(cè)序挖掘柑橘珠心胚起始相關(guān)miRNA
　　以一對(duì)橘與一對(duì)柚/葡萄柚單胚/多胚品種為材料，選擇珠心胚起始細(xì)胞出現(xiàn)前后兩個(gè)時(shí)期，取胚珠進(jìn)行小RNA深度測(cè)序。在橘胚珠中鑒定了91條已知的和60條新的miRNAs，預(yù)測(cè)的靶基因分別為695和163個(gè);柚/葡萄柚中共鑒定了93條已知的及66條新的miRNAs，分別對(duì)應(yīng)417和152個(gè)預(yù)測(cè)的靶基因。在一對(duì)橘品種的胚珠中兩個(gè)時(shí)期均得到13個(gè)差異表達(dá)miRNAs，而柚/葡萄柚分別獲得31和4

4、1個(gè)，僅有2個(gè)差異表達(dá)miRNAs(保守的miR1446a和新的miRN23-5p)在這兩對(duì)材料的胚珠中都表現(xiàn)差異表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證了其中6個(gè)差異表達(dá)的miRNAs，大部分與測(cè)序結(jié)果一致。基于前人的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行重新優(yōu)化分析，獲得305個(gè)共有的差異表達(dá)基因。Gene ontology(GO)分析表明逆境響應(yīng)過(guò)程在上調(diào)基因中顯著富集，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在該生物過(guò)程中大部分基因與氧化逆境響應(yīng)相關(guān)，這些基因在兩個(gè)多胚品種的胚珠顯著高于

5、單胚品種胚珠。因此，推測(cè)氧化逆境響應(yīng)過(guò)程可能是影響柑橘珠心胚起始的重要因素。qRT-PCR分析表明，miRN23-5p在2個(gè)多胚品種6個(gè)胚珠發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量均低于單胚品種，而其預(yù)測(cè)的2個(gè)靶基因表達(dá)模式恰好相反。煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步表明，miRN23-5p能夠剪切其中一個(gè)靶基因Cs9g06920，暗示miRN23-5p與Cs9g06920的互作可能參與珠心胚起始過(guò)程。
　　2.csi-miR156a在體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的功能驗(yàn)證及

6、調(diào)控作用研究
　　利用RACE技術(shù)獲得csi-miR156a基因編碼區(qū)CsMIR156A全長(zhǎng)，擴(kuò)增結(jié)果表明該序列在8個(gè)柑橘品種間無(wú)明顯差異。將攜帶前體MIR156a的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入弱胚性的山金柑愈傷組織，并成功獲得轉(zhuǎn)基因愈傷組織系。體胚發(fā)生能力分析表明，轉(zhuǎn)基因愈傷系的體胚發(fā)生能力明顯高于野生型。qRT-PCR分析表明，2個(gè)靶SPL（CsSPL3和CsSPL14）在miR156超表達(dá)愈傷組織系中的表達(dá)相比野生型下調(diào)，且這2個(gè)靶SP

7、L基因的表達(dá)模式與柑橘不同品種的體胚發(fā)生能力負(fù)相關(guān)，推測(cè)這兩個(gè)SPL可能負(fù)調(diào)控體胚發(fā)生能力。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)SPL均定位于細(xì)胞核。轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CsSPL14有自激活現(xiàn)象，能夠激活下游報(bào)告基因的表達(dá);而CsSPL3沒(méi)有自激活。構(gòu)建CsSPL3和CsSPL14的RNAi載體，轉(zhuǎn)化弱胚性的山金柑愈傷組織;經(jīng)體胚誘導(dǎo)及體胚發(fā)生能力統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，與csi-miR156a超量表達(dá)愈傷組織系表型相似，山金柑CsSPL3和CsSPL14RN

8、Ai愈傷組織系的體胚發(fā)生能力均顯著提高。
　　利用數(shù)字表達(dá)譜分析比較超量表達(dá)miR156的山金柑愈傷組織系與野生型，發(fā)現(xiàn)參與逆境響應(yīng)及激素介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等生物過(guò)程在上調(diào)基因顯著富集，而下調(diào)基因主要參與甲基化及細(xì)胞周期等相關(guān)過(guò)程。qRT-PCR檢測(cè)8個(gè)參與逆境響應(yīng)過(guò)程差異表達(dá)基因的表達(dá)情況，表明這些基因在miR156超量表達(dá)與2個(gè)SPL基因干涉系均表現(xiàn)相似的表達(dá)模式。利用酵母雙雜交篩庫(kù)及點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證獲得2個(gè)與CsSPL14潛在的互

9、作蛋白，分別為CsARK1和SnRK催化亞基KIN10(CsAKIN10)。隨后利用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)再次驗(yàn)證了以上互作關(guān)系。亞細(xì)胞定位分析表明CsAKIN10定位在細(xì)胞核。
　　綜上所述，本研究鑒定了柑橘兩對(duì)單胚/多胚品種胚珠中已知與新的miRNA，并發(fā)掘了可能與珠心胚起始相關(guān)的“miRNA-靶基因”調(diào)控組合;驗(yàn)證了csi-miR156a及其靶基因SPLs在體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中的功能，篩選了其中一個(gè)SPL的互作蛋白，并對(duì)SPL與其