單鏈可變區(qū)片段與趨化因子融合的獨(dú)特型淋巴瘤疫苗原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、目的： B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面分泌的膜免疫球蛋白(smIg)是一種明確的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，結(jié)合免疫佐劑主動(dòng)免疫接種后可以激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，靠自身的力量消滅體內(nèi)殘存的腫瘤細(xì)胞，為徹底治愈淋巴瘤提供可能。利用基因工程技術(shù)，將膜免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因(VH)和輕鏈可變區(qū)基因(VL)連接的單鏈小分子即scFv，可以模擬完整smIg的抗原性，但免疫原性弱，結(jié)合合適的免疫佐劑后，能增強(qiáng)其免疫原性，可以作為瘤苗進(jìn)行免疫接種。本研究以BA

2、LB/c小鼠源B細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞株A20為模型，制備smlg的scFV片段與免疫佐劑趨化因子MCP3融合的獨(dú)特型蛋白疫苗，為進(jìn)一步進(jìn)行小鼠體內(nèi)活性試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法： 重疊延伸拼接PCR技術(shù)，通過設(shè)計(jì)嵌合引物對兩個(gè)不同目的序列進(jìn)行連接。實(shí)驗(yàn)中，先后兩次應(yīng)用重疊延伸拼接PCR技術(shù)，制備小鼠B細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞表面的獨(dú)特型膜免疫球蛋白的scFv基因片段及scFv和。MCP3融合基因片段。按重疊延伸PCR反應(yīng)原理，設(shè)計(jì)6對引物

3、，將Ig VH和Ig VLcDNA用一段編碼(Gly<,4>Ser)<,3>連接肽的基因序列連接，然后，將scFv片段與免疫佐劑MCP3基因序列通過一段編碼NDAQAPKS的spacer序列連接起來。其中，spacer序列可以保證scFv和MCP3蛋白正確折疊并保持各自獨(dú)立的生物學(xué)活性。獲得的scFv-MCP3融合基因片段經(jīng)Sac I、Kpn I雙酶切、定向克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pGLo,再次酶切鑒定及測定核酸序列準(zhǔn)確無誤后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中

4、表達(dá)融合蛋白。 1、培養(yǎng)A20細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)總RNA：B細(xì)胞性淋巴瘤細(xì)胞株A20培養(yǎng)于高糖．DMEM培養(yǎng)基中，收獲對數(shù)生長期的細(xì)胞，用Trizol試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，瓊脂糖電泳鑒定RNA的質(zhì)量，分光光度計(jì)定量。 2、RT-PCR．法擴(kuò)增IgVH、IgVL cDNA片段：以抽提的A20細(xì)胞內(nèi)的總RNA為模板，六核隨機(jī)引物法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，分別以VHo5’和VHo3’、VLo5’和VLo3’為引物

5、，擴(kuò)增IgVH、IgVL cDNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定后進(jìn)行核酸測序。 3、重疊延伸PCR法制備scFv基因片段：反應(yīng)分兩步進(jìn)行：第一步，以IgVH、IgVL cDNA片段為模板，分別用特異性引物VH 5’和VH 3’、VL 5’和VL 3’對IgVH、IgVL cDNA片段進(jìn)行修飾擴(kuò)增，使IgVH cDNA下游末端與IgVLcDNA上游起始端出現(xiàn)互補(bǔ)結(jié)合區(qū)；第二步，等摩爾數(shù)的IgVH、IgVLcDNA修飾擴(kuò)增片段為模板，加

6、入同一反應(yīng)體系中，變性后雙鏈DNA解鏈，發(fā)生退火時(shí)，少量的互補(bǔ)末端的模板互補(bǔ)結(jié)合，互為模板并提供羥基末端，反向延伸，制備scFv片段。數(shù)個(gè)循環(huán)后加入引物VH 5’和VL 3’，按相同的PCR參數(shù)循環(huán)，得到一定量的IgVH cDNA和IgVL cDNA連接片段即scFv片段。 4、MCP3基因的擴(kuò)增：以含有MCP3基因序列的質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)引物MCP3 5’和MCP3 3’擴(kuò)增MCP3基因。 5、重疊延伸PCR法制備

7、scFv與MCP3的融合基因片段：與制備scFv片段過程第二步相同：以等摩爾數(shù)的scFv基因片段和MCP3修飾片段為模板，以VH 5’和MCP3 3’為引物，連接制備scFv-MCP3融合基因片段。 6、scFv-MCP3融合基因片段克隆質(zhì)粒的構(gòu)建：scFv-MCP3融合基因片段與pGEM-T載體連接，操作按說明書，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5 α，涂到LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色克隆，放

8、大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR及Sac I、Kpn I雙酶切鑒定陽性克隆，送大連寶生物公司測序。 7、scFv-MCP3融合基因片段原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：經(jīng)測序證實(shí)的陽性重組質(zhì)粒經(jīng)Sac I、Kpn I雙酶切后，回收目的基因片段，然后經(jīng)T4連接酶與同樣處理的表達(dá)質(zhì)粒載體pGLo進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α，涂布于LB/氨芐平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑選數(shù)個(gè)菌落放大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒。酶切及PCR鑒定陽性克隆。 8、scFv-

9、MCP3融合蛋白疫苗的表達(dá)：含有重組原核表達(dá)質(zhì)粒的單克隆DH5 α菌培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液.A<,600nm>=0.6左右時(shí)加入0.01％阿拉伯糖(L-arabinose)30℃低溫誘導(dǎo)4小時(shí)，誘導(dǎo)前后菌體制樣，10％SDS-PAGE凝膠電泳檢測。 結(jié)果： 1、基因片段的擴(kuò)增及測序鑒定：RT-PCR擴(kuò)增IgVH、IKVL cDNA的產(chǎn)物與預(yù)期大小一致，約400bp左右。測序結(jié)果顯示IgVH、IgVL cDNA序列與

10、文獻(xiàn)報(bào)道一致，IgVH、IgVL基因序列翻譯成氨基酸序列后與文獻(xiàn)報(bào)道序列基本一致。測序后的IgVH、IgVL cDNA經(jīng)相應(yīng)的引物修飾后長度分別為407bp、401bp。以含MCP3基因的質(zhì)粒為模板擴(kuò)增MCP3基因，產(chǎn)物大小為335bp。經(jīng)重疊延伸PCR獲得scFv片段，產(chǎn)物為793bp，擴(kuò)增scFv-MCP3融合基因片段，產(chǎn)物大小1111bp，與pGEM載體連接后挑選陽性的克隆測序，結(jié)果表明scFv和MCP3連接正確，并且無移碼突變發(fā)

11、生。在融合基因的制備擴(kuò)增過程中，在IgVL序列內(nèi)第231位核苷酸發(fā)生A→G堿基突變，其所在的讀碼框由ACA變?yōu)锳CG，但均編碼Thr，為無義突變，不影響蛋白表達(dá)后的氨基酸序列，未予修正。 2、重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定：重組表達(dá)質(zhì)粒pGLo/scFv.MCP3被Sac I和Kpn I雙酶切為約1100bp和5400bp兩條片段。酶切結(jié)果表明成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGLo/scFv-MCP3。 3、融合蛋白質(zhì)的表達(dá)：含重組表達(dá)質(zhì)

12、粒pGLo/scFv-MCP3的大腸桿菌DH5a培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，阿拉伯糖30℃誘導(dǎo)4小時(shí)后可高效表達(dá)融合蛋白GFP-scFv-MCP3，SDS-PAGE電泳分析證實(shí)融合蛋白的表達(dá)量占菌體蛋白30％，融合蛋白的大小為65kD。與預(yù)期結(jié)果相符。 結(jié)論： 1、成功構(gòu)建鼠源scFv片段與趨化因子MCP3融合的獨(dú)特型B細(xì)胞淋巴瘤疫苗表達(dá)質(zhì)粒pGLo/scFv.MCP3，并實(shí)現(xiàn)融合蛋白的初步表達(dá)。為融合蛋白疫苗體內(nèi)活性檢測準(zhǔn)備實(shí)

13、驗(yàn)基礎(chǔ)。 2、重疊延伸拼接PCR過程中堿基與模板的錯(cuò)配率要明顯高于常規(guī)PCR反應(yīng)，即使使用保真性較好的聚合酶也不能避免錯(cuò)配的發(fā)生，可能導(dǎo)致堿基序列的點(diǎn)突變。測序結(jié)果驗(yàn)證序列拼接準(zhǔn)確無誤并且無移碼突變后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。因此一定要使用保真性更高的DNA聚合酶，盡量避免點(diǎn)突變的發(fā)生。 3、可以對經(jīng)典重疊延伸PCR技術(shù)的步驟進(jìn)行簡化，將等摩爾數(shù)的模板、引物同時(shí)加入反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，就可以得到一定豐度的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。