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文檔簡介
1、梨輪紋病是由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea(Moug:Fr) Ces&De Not)引起的真菌病害,能夠造成梨樹枝條枯死、枝干粗皮和潰瘍,果實(shí)腐爛。輪紋病在我國南北梨產(chǎn)區(qū)的危害呈逐年加重趨勢(shì)。弱毒相關(guān)病毒導(dǎo)致植物病原真菌致病力衰退,可作為梨輪紋病生物防治的另一條重要途徑。
本研究對(duì)前期保存的復(fù)合感染產(chǎn)黃青霉病毒Botryosphaeria dothidea chrysovirus1(BdCV1)和雙
2、分體病毒Botryosphaeria dothidea partitivirus1(BdPV1)病毒的LW-1菌株進(jìn)行分離,旨在獲得僅感染BdCV1菌株(命名為LW-C),評(píng)價(jià)該病毒對(duì)梨輪紋病菌分離株的影響;檢測(cè)并分析來源于湖北省梨輪紋病菌分離株攜帶dsRNA病毒的多樣性,挖掘防治梨輪紋病害的生防資源。以復(fù)合感染BdPV1和BdCV1的梨輪紋菌株LW-1、單獨(dú)感染BdCV1的LW-C、單獨(dú)感染BdPV1的LW-P以及無病毒感染的Mock
3、菌株作為四組材料,構(gòu)建了4個(gè)文庫(分別命名為LW-CP,LW-C,LW-P和Mock),進(jìn)行de novo測(cè)序和小RNA測(cè)序,獲得梨輪紋病菌unigene序列信息,分析病毒感染條件下梨輪紋病菌差異表達(dá)基因;結(jié)合采用小RNA高通量測(cè)序技術(shù),以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫作為miRNA靶基因預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)庫,對(duì)mRNA/miRNA進(jìn)行了聯(lián)合分析,研究結(jié)果旨在獲得與真菌病毒互作和與梨輪紋病菌致病相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,挖掘防治梨輪紋病菌潛在的基因資源,為梨
4、輪紋病害防治提供新途徑。取得的具體研究結(jié)果如下::
1.對(duì)與LW-1菌株來源于同一采集地‘湖北省武漢市果樹茶葉研究所砂梨種質(zhì)資源圃’的梨樹輪紋病害樣品進(jìn)行采集,經(jīng)分離、純化,菌落形態(tài)觀察,分子鑒定及其致病力測(cè)定,結(jié)果表明,來源于湖北省的6個(gè)分離株均為強(qiáng)致病力梨輪紋病菌株B.dothdiea,經(jīng)dsRNA檢測(cè),6個(gè)分離菌株均攜帶分子量為1-7kb之間多條dsRNA條帶,存在病毒多樣性;研究結(jié)果為探究真菌病毒防治梨輪紋病害提供生防
5、資源以及真菌病毒分類和進(jìn)化研究提供材料。
2.通過單菌絲分離從LW-1菌株中獲得僅感染BdCV1的梨輪紋病菌菌株(命名為LW-C),證實(shí)了LW-C具有弱毒特性;水平轉(zhuǎn)染結(jié)果明確了BdCV1因子對(duì)梨輪紋菌菌落形態(tài)、生長速度有抑制作用,對(duì)梨輪紋病菌寄主有弱致病力。首次證實(shí)了產(chǎn)黃青霉病毒科BdCV1成員是引起梨輪紋菌株致病力衰退的主要因子,為真菌病毒防治果樹輪紋病害提供了新穎的生防材料。
3.采用RT-qPCR分析了BdC
6、V1和BdPV1的cp、RdRp基因在LW-1、LW-C和LW-P菌株培養(yǎng)5d、10d、15d的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示BdCV1和BdPV1的cp、RdRp基因分別在各自單獨(dú)感染和復(fù)合感染的梨輪紋病菌中表達(dá)量是有差異的,揭示了病毒間互作對(duì)其表達(dá)量有影響。
4.構(gòu)建了真菌病毒感染條件下梨輪紋病菌4個(gè)文庫,對(duì)其進(jìn)行了De novo測(cè)序,共獲得30,058個(gè)Unigene,平均長度為2,128bp,在7大基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了注釋,明確了功
7、能分類。獲得了LW-CP/Mock上調(diào)表達(dá)基因5605個(gè),下調(diào)基因3301個(gè);LW-C/Mock上調(diào)表達(dá)基因4478個(gè),下調(diào)基因4311個(gè);LW-P/Mock上調(diào)表達(dá)基因2596個(gè),下調(diào)基因2328個(gè);以上結(jié)果表明,受BdCV1感染的差異表達(dá)基因數(shù)量最多,推測(cè)BdCV1對(duì)梨輪紋病菌寄主基因表達(dá)影響明顯。采用RT-qPCR對(duì)病毒感染條件下候選的9個(gè)差異基因表達(dá)量進(jìn)行分析,檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的表達(dá)趨勢(shì)一致,驗(yàn)證了RNA-seq測(cè)序結(jié)果
8、的可靠性,明確了這些差異基因在病毒感染條件下的表達(dá)模式。另外,在梨輪紋病菌中檢測(cè)到參與基因沉默途徑的幾個(gè)關(guān)鍵基因(Ago、Dicer和RdRp)且在病毒感染條件下均為上調(diào)表達(dá)。對(duì)病毒感染條件下3組對(duì)比文庫的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路分析,結(jié)果顯示,這些基因主要在代謝途徑以及生物合成二級(jí)代謝途徑中顯著富集,參與細(xì)胞復(fù)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等抗病途徑。
5.小RNA高通量測(cè)序發(fā)掘真菌病毒感染響應(yīng)梨輪紋病菌miRNAs的分析:
9、miRNA長度大小以21和22nt為主,LW-CP、LW-C、LW-P和Mock文庫中分別鑒定出63個(gè)、48個(gè)、83個(gè)和86個(gè)miRNAs。病毒感染條件下,3組對(duì)比文庫LW-CP/Mock,LW-C/Mock和LW-P/Mock共有110個(gè),120個(gè)和88個(gè)差異表達(dá)的已知miRNAs。韋恩圖結(jié)果顯示,病毒感染條件下的3個(gè)對(duì)比文庫中公有57個(gè)已知miRNA差異表達(dá)。另外,LW-CP、LW-C、LW-P和Mock文庫中分別鑒定出25個(gè),37
10、個(gè),20個(gè)和19個(gè)新的miRNA;新的miRNA在梨輪紋病菌文庫中表達(dá)量較低。病毒感染條件下,LW-CP/Mock,LW-C/Mock和LW-P/Mock共有19個(gè),15個(gè)和14個(gè)新的miRNAs差異表達(dá);韋恩圖結(jié)果顯示,病毒感染條件下的3個(gè)對(duì)比文庫中公有11個(gè)新的miRNA差異表達(dá);新的miRNA成熟序列5’末端第一個(gè)堿基主要為U。
6.病毒感染條件下梨輪紋病菌miRNA/mRNA負(fù)調(diào)控的聯(lián)合分析結(jié)果顯示,GO功能分析主要分
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