團頭魴鐵蛋白和轉鐵蛋白基因在嗜水氣單胞菌感染過程中的免疫功能研究.pdf

1、鐵是生物體不可缺少的微量元素，在多種生理活動中都發(fā)揮著重要作用，然而鐵過剩不僅會刺激機體產(chǎn)生有害的自由基，還會利于體內病原微生物的增殖。因此，維持機體鐵穩(wěn)態(tài)至關重要，其中鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)T）和轉鐵蛋白（Transferrin，TF）分別作為鐵儲存和轉運蛋白而發(fā)揮著關鍵作用。一直以來，鐵是細菌和宿主爭奪營養(yǎng)源的核心，許多鐵代謝相關基因都會參與宿主的先天性免疫反應。近年來，鐵代謝通路的免疫功能研究越來越受關注，相關報道也逐漸增多

2、。團頭魴（Megalobrama amblycephala）作為我國的一種大宗淡水魚類，近年來由于集約化養(yǎng)殖和環(huán)境惡化等原因導致多種病害頻發(fā)，其中以嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）感染引發(fā)的細菌性敗血癥尤為嚴重。本研究以團頭魴為研究對象，對其Ft（M.amblycephala ferritins，MamFers）和Tf(M.amblycephala transferrin，MamTf)基因進行了克隆、表達及

3、重組蛋白活性檢測，并在L8824細胞上過表達后進行數(shù)字表達譜測序及差異基因篩選，最后實驗驗證了MamFers和MamTf對鐵代謝和免疫通路的調控作用，旨在探索MamFers和MamTf基因在鐵代謝和免疫應答過程中發(fā)揮的作用，為魚類細菌性疾病的預防和治療及抗病育種提供理論依據(jù)。本文主要研究結果如下:
　　1.本研究克隆鑒定了團頭魴Ft基因兩個亞基(M.amblycephala ferritin Hand Msubunits，MamF

4、erH和MamFerM)，序列分析表明這兩個亞基都含有哺乳動物鐵蛋白H亞基的鐵氧化酶活性中心結構，而且MamFerM還含有哺乳動物鐵蛋白L亞基的成核作用位點。MamFerH和MamFerM的5非編碼區(qū)(5'-Untranslated Regions，5'-UTR)都含有鐵反應元件(Iron Responsive Element,IRE)元件，但預測的二級結構存在差異。序列比對分析表明MamFerH和MamFerM間的同源性僅有65％，并

5、且進化分析表明鐵蛋白H和M亞基分別聚為一支，表明兩者由不同的基因編碼而成。MamFerH和MamFerM具有類似的早期發(fā)育表達模式，都在出膜后表達上調。然而，MamFerH和MamFerM具有不同的組織表達模式，MamFer主要表達于血液和腦，而MamFerM則在脾臟、肝臟和腎臟中高表達。嗜水氣單胞菌感染后，MamFerH和MamFerM在mRNA和蛋白水平都能被誘導而顯著上調表達，免疫組化和免疫熒光分析表明感染后兩者在細胞質和細胞核上

6、的分布都會顯著增強，其中MamFerH具有更快速和更顯著的急性期反應。相比之下，重組MamFerH蛋白也表現(xiàn)出更有效的抑菌作用，而重組MamFerM蛋白則具有更有效的鐵結合活性。
　　2.本研究還克隆了MamTf基因，MamTf蛋白由兩個同源結構域（N端和C端）組成，每個結構域都含有4個鐵離子結合位點。MamTf在團頭魴肝臟中特異性高表達，表達水平顯著高于其他組織。發(fā)育期表達分析顯示MamTf在12 hpf(hours post

7、fertilization)開始表達并逐漸上調，隨后在出膜期(32 hpf)顯著下調，出膜后在2 dph(days post hatching)顯著上調并達到最大值。嗜水氣單胞菌感染后MamTf及其受體1在團頭魴肝、脾、腎3個組織中的mRNA和蛋白表達水平都被誘導上調。普魯士藍染色顯示感染后肝細胞內的鐵含量顯著增多，免疫組化分析表明感染后MamTf及其受體1在肝細胞膜和胞內分布增多，表明兩者可能通過內在化將鐵離子轉運至胞內，致使團頭魴肝

8、細胞內鐵含量上調。重組MamTf蛋白的鐵結合活性呈現(xiàn)出濃度依賴性上升方式，并且體外實驗表明添加重組MamTf蛋白可以在一定程度上抑制嗜水氣單胞菌的增殖。
　　3.為進一步研究MamFers和Mam Tf基因的轉錄調控作用，本研究在L8824細胞中過表達MamFerH、MamFerM和MamTf后進行數(shù)字表達譜測序。比較數(shù)字表達譜分析表明MamFerH和MamFerM的下游調控通路包括免疫系統(tǒng)及抗菌反應，qRT-PCR（Quanti

9、tative Real-time Polymerase Chain Reaction）驗證表明MamFers和MamTf過表達后分別能誘導TNFα(Tumor Necrosis Factor alpha)和iNOS（Inducible Nitric Oxide Synthase）基因表達上調。NFκB(Nuclear Factorκ B)作為一種重要的轉錄調控因子，廣泛參與機體免疫應答，包括對多種細胞因子的表達調控作用。本研究發(fā)現(xiàn)Mam

10、Fers和MamTf過表達后能促進NFκB的轉錄活性及pIKK蛋白磷酸化水平的上調。添加BAY11-7082（IκBα抑制劑）會顯著抑制MamFers和Mam Tf過表達后對細胞因子的誘導表達作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達后也能顯著上調MAPK(Mitogen-activated ProteinKinase)蛋白的磷酸化水平，添加U0126（MEK1/2抑制劑）會顯著抑制MamFers和Mam Tf過表達后對促炎

11、細胞因子的誘導表達作用。上述結果表明，MAPK和NFκB能介導MamFers和MamTf對促炎細胞因子的表達調控。
　　4.本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達會抑制嗜水氣單胞菌Ah對EPC細胞的粘附，而干擾后會促進Ah的粘附過程。qRT-PCR分析表明MamFers和MamTf過表達后ECM(Extracellular Matrixc)相關基因fibronectin(FN)和Integrinbeta1(Intgβ1)表達都

12、會被調控。然而兩者具有截然相反地調控方式，MamFers和MamTf過表達后FN表達上調而Intgβ1下調，MamFers和MamTf干擾后表達趨勢相反。進一步研究表明，F(xiàn)N和Intgβ1都參與了介導MamFers和MamTf對Ah粘附過程的調控。
　　5.本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過表達會促進NLRC5(NOD-like ReceptorFamily CARD Domain Containing5)、β2M(β2 Mi

13、croglobulin)和MHCⅠ（MajorHistocompatibility Complex ClassⅠ）表達上調。本研究將siRNA-NLRC5與MamFers和Mam Tf過表達質粒共轉染后可以顯著抑制MamFers和MamTf對β2M/MHCⅠ表達的誘導作用，表明MamFers和Mam Tf可以通過NLRC5調控β2M/MHCⅠ的表達。此外，MamFers和Mam Tf過表達會顯著促進hepcidin基因表達上調，而siR