乙酰肝素酶促進(jìn)骨生成和骨折愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的及研究背景
　　 骨質(zhì)疏松及伴隨的骨折是病人致殘和致死的重要原因。乙酰肝素酶(HPSE)，一種促進(jìn)血管生成的因子，特異地降解廣泛存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白多糖，參與多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中血管生成。盡管如此，它在促進(jìn)骨生長(zhǎng)中的作用仍然不清楚。本實(shí)驗(yàn)的目的:1.探討HPSE在刺激成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的效果;2.比較HPSE刺激健康人和骨質(zhì)疏松患者來(lái)源的成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的差異;3.觀察

2、HPSE在小鼠骨折模型中促進(jìn)骨折愈合中的效果，并探討HPSE促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制。
　　 方法
　　 1.從人的血小板中提取HPSE(澳大利亞國(guó)立大學(xué)TORU實(shí)驗(yàn)室提取、純化)。分別從7例健康成人和7例骨質(zhì)疏松患者采集骨組織，分離成骨細(xì)胞并進(jìn)行體外原代培養(yǎng)。HPSE原液(400μg/mL)最初由培養(yǎng)基(α-MEM)制備并用0.22μm的過濾器的消毒。將細(xì)胞以4000個(gè)/cm2的密度接種到25cm2的培養(yǎng)瓶，96孔板，和6孔

3、板上，經(jīng)過48小時(shí)的培養(yǎng)，用不同濃度的HPSE治療細(xì)胞，包括6μg/mL，3μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL，and0μg/mL的對(duì)照組。加入HPSE后，細(xì)胞再培養(yǎng)3，5或14天，取決于不同的實(shí)驗(yàn)。在培養(yǎng)的第7天，更換細(xì)胞培養(yǎng)液并加入新鮮的HPSE。另外，骨形成蛋白-1(osteogenicprotein-1，OP-1，0.2μg/mL)用來(lái)替換HPSE作為陽(yáng)性對(duì)照。將細(xì)胞接種到96孔板進(jìn)行ATPLite檢

4、測(cè)，接種到6孔板進(jìn)行骨礦化檢測(cè)，接種到25cm2的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測(cè)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　 2.選用36只8-10周齡的Balb/C小鼠，隨機(jī)選取18只為HPSE治療組;另外的18只小鼠為對(duì)照組。所有小鼠以右后肢股骨為研究對(duì)緣，建立小鼠股骨骨折模型。治療組中將10ug/mL的HPSE注射到骨折部位，對(duì)照組中將相同劑量的生理鹽水注射到骨折部位。術(shù)后1周、2周和4周，獲取治療組及對(duì)照組標(biāo)本，將骨折的股骨進(jìn)行前后位和側(cè)位

5、的X線檢查，分別通過正側(cè)位X線片測(cè)量骨折部位骨痂的大小;將獲取的標(biāo)本送到悉尼大學(xué)進(jìn)行Micro-CT掃描并三維重建，測(cè)量組織總量、骨組織量等參數(shù);取股骨標(biāo)本的股骨髁部位的松質(zhì)骨進(jìn)行骨小梁的重建和測(cè)量，觀察骨小梁數(shù)目、骨小梁厚度、骨小梁空隙以及骨小梁形態(tài)因子，評(píng)估HPSE在骨折愈合過程中的作用。將獲取的骨組織制成5μm的組織切片并行HE染色，光學(xué)顯微鏡下定性觀察骨折部位骨痂形成的情況;術(shù)后1周，收集治療組和對(duì)照組股骨骨折標(biāo)本時(shí)，留取部分骨

6、組織，進(jìn)行體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)，將HPSE加入培養(yǎng)體系后，通過RT2-qPCR序列分析，觀察HPSE對(duì)小鼠成骨細(xì)胞中84個(gè)骨生成相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果
　　 1.通過光學(xué)顯微鏡觀察后，用或不用HPSE治療的細(xì)胞均表現(xiàn)相同的成骨細(xì)胞表型，說(shuō)明加入HPSE后，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變。與非治療的對(duì)照組相比，HPSE治療的成骨細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，而不是細(xì)胞大小增加。與健康人標(biāo)本來(lái)源的成骨細(xì)胞相比，骨質(zhì)疏松標(biāo)本來(lái)源的成骨細(xì)胞對(duì)H

7、PSE治療的更敏感，骨質(zhì)疏松來(lái)源的成骨細(xì)胞數(shù)量的增加更明顯。ATPLite檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過HPSE治療后，健康成骨細(xì)胞中ATP的增加多于骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞，在培養(yǎng)的第5天，HPSE治療的兩種成骨細(xì)胞中ATP明顯增加并存在劑量依賴性。堿性磷酸酶檢測(cè)結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松成骨細(xì)胞中ALP的活性水平高于健康成骨細(xì)胞，在培養(yǎng)的第5天，HPSE能顯著增加所有標(biāo)本中的ALP活性并具有劑量依賴性。通過計(jì)算茜紅索-S(AR-S)結(jié)合的礦化結(jié)節(jié)來(lái)分析細(xì)胞中C

8、a的水平，在所有標(biāo)本中，HPSE能顯著地增加成骨細(xì)胞Ca礦物質(zhì)的形成，但是在相同的HPSE治療劑量下，骨質(zhì)疏松標(biāo)本中Ca含量的增加水平高于健康標(biāo)本。ELISA法和流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，HPSE對(duì)人成骨細(xì)胞的刺激作用和組蛋白的修飾有關(guān)，位于S28的組蛋白H3的磷酸化起主要作用，而不是位于S10的組蛋白H3的磷酸化或乙酰化。
　　 2.在HPSE對(duì)小鼠骨折模型中骨折愈合的實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后1周觀察兩組標(biāo)本X線檢查顯示骨折周圍可見骨痂形成

9、，骨折線較為明顯;術(shù)盾2周觀察兩組標(biāo)本骨折線均模糊不清，可見大量骨痂形成。術(shù)后4周，骨折線消失，通過X線判定骨折已愈合。前后位X線片測(cè)量顯示術(shù)后1周HPSE治療組標(biāo)本的骨痂的最大橫徑與對(duì)照組標(biāo)本骨痂的最大橫徑相比，顯著增加（3.26±0.13mmVS2.51±0.12mm，P=0.0321）;術(shù)后2周和4周前后位X線片測(cè)量結(jié)果，以及術(shù)后1周、2周和4周側(cè)位X線片測(cè)量結(jié)果比較無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后1周，組織切片HE染色顯示骨折周圍骨痂中

10、軟骨細(xì)胞較多，HPSE治療組標(biāo)本中骨痂內(nèi)形成的微血管較多。術(shù)后2周，骨痂完全被骨折周圍的新骨和骨折中心的軟骨細(xì)胞占據(jù)。術(shù)后4周，在骨折部位新骨形成，形成明顯的骨橋連接，骨髓腔再通，骨痂部分被吸收。Micro-CT結(jié)果顯示術(shù)后1周的標(biāo)本中，治療組的骨組織的含量（BV/TV）平均為9.24±0.9％，而對(duì)照組BV/TV平均為4.64±0.7％，兩組之間比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)三維重建獲得結(jié)果分析，術(shù)后1周，骨小梁的數(shù)目(Tb.N)在治

11、療組和對(duì)照組標(biāo)本平均為0.28±0.081/mm和0.1326±0.021/mm;骨小梁之間的間隙(Tb.SP)在治療組和對(duì)照組標(biāo)本中的平均值分別為1.67±0.12mm和2.36±0.14mm;而骨小梁形態(tài)因子(Tb.Pf)在治療組和對(duì)照組標(biāo)本中的平均值分別為-2.90±0.811/mm和4.97±1.641/mm;Tb.N、Tb.SP和Tb.Pf兩組之間比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后2周的標(biāo)本中，治療組的BV/TV平均為9.24±0

12、.4％，而對(duì)照組BV/TV平均為7.36±0.2％;兩組之間比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)三維重建獲得結(jié)果分析，術(shù)后2周，Tb.N在治療組和對(duì)照組標(biāo)本中平均為0.32±0.021/mm和0.28±0.031/mm，兩組之間比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tb.SP、Tb.Pf及Tb.Th兩組之間比較無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。術(shù)后4周的標(biāo)本中，Micro-CT對(duì)治療組和對(duì)照組標(biāo)本測(cè)量的所有指標(biāo)，如BV、BV/TV、TV、Tb.N、Tb.SP、Tb.P

13、f及Tb.Th等數(shù)據(jù)在兩組之間比較無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在HPSE治療的標(biāo)本中，BMP2，ALPL，CSF2，F(xiàn)GFR2和SMAD2均上調(diào)，表明HPSE刺激的普遍參與。經(jīng)HPSE刺激后，BMP6等17個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，而RUNX2等8個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論
　　 1.通過本研究結(jié)果顯示，HPSE能夠促進(jìn)健康及骨質(zhì)疏松來(lái)源的體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化。
　　 2.在小鼠股骨骨折模型中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)H