“雙固一通”針法對帕金森病模型大鼠中樞免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究.pdf

1、目的： 帕金森病(Parkinson's disease，PD)主要以中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元進行性變性喪失為特征，是一種好發(fā)于中老年人常見的緩慢進展性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，發(fā)病率在神經(jīng)變性疾病中處于第二位，而且發(fā)病率隨著年齡增長而逐漸增高，65歲以上的老年人中，發(fā)病率占到1％～3％。當紋狀體內(nèi)多巴胺水平減少70％～80％，中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性超過50％時，與兒茶酚胺能神經(jīng)遞質(zhì)之間的功能失調(diào)，導致錐體外系運動功能障礙，如出現(xiàn)靜

2、止性震顫、強直、運動過緩和姿勢不穩(wěn)等表現(xiàn)。 研究顯示，幾乎所有的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中小膠質(zhì)細胞均有可能參與到發(fā)生、發(fā)展的各個階段，但在PD的發(fā)展中小膠質(zhì)細胞的激活具有更加重要的意義。首先，氧自由基損傷在多巴胺能神經(jīng)元損傷中具有決定意義，而小膠質(zhì)細胞的激活是大量自由基產(chǎn)生的主要來源，其次，組織學研究表明中腦黑質(zhì)區(qū)是小膠質(zhì)細胞最富集的區(qū)域。在PD患者腦脊液中，伴隨著中腦黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元選擇性喪失的是大量表達人類白細胞抗原(H

3、LA)的小膠質(zhì)細胞的激活，DA能神經(jīng)元的喪失程度與小膠質(zhì)細胞激活呈平行關系。小膠質(zhì)細胞激活后所釋放的前炎癥細胞因子和過量的自由基介導了DA能神經(jīng)元的損傷，因此只要能抑制小膠質(zhì)細胞激活，就能最大限度的減少DA能神經(jīng)元的丟失。 近年來，傳統(tǒng)中醫(yī)藥療法治療PD的研究取得了一定的進展，尤其是針灸作為一種獨特、安全、方便的治療方法已經(jīng)越來越多地運用于臨床，取得了較為肯定的療效。毫針、頭針、電針等常用的針灸法用于帕金森氏病的治療，針灸可以對

4、肌電位產(chǎn)生影響、調(diào)整抗氧化酶系統(tǒng)，提高腦內(nèi)DA水平及對免疫因子成分產(chǎn)生影響。但有關針灸治療PD作用機制的深入研究甚少。我們在前期工作中，導師王華教授根據(jù)祖國醫(yī)學理論，認為肝風內(nèi)動是本病的主要病機，主病在肝，病位在腦，確定了通調(diào)腦絡，熄風止顫，柔肝舒筋的治療原則，根據(jù)“雙固一通”針灸法的指導思想，選取關元、足三里、太沖、風府四穴，對PD模型大鼠施以電針治療，發(fā)現(xiàn)針刺可使PD大鼠中腦黑質(zhì)TH活性增強，大腦皮質(zhì)一氧化氮合酶(NOS)表達降低，

5、紋狀體谷氨酸(Glu)含量下降，膠質(zhì)細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)表達增強，并觀察了黑質(zhì)神經(jīng)元的超微病理改變。本課題擬在前期工作的基礎上，建立早中期PD大鼠模型，采用免疫學和分子生物學實驗方法，從細胞免疫、體液免疫、免疫調(diào)控等方面入手，在細胞和分子水平闡明針刺治療對PD免疫功能的調(diào)節(jié)作用，從而為揭示針刺治療PD的作用機制提供實驗依據(jù)，并為臨床治療提供指導作用。 方法： 1.建立早中期偏側(cè)PD大鼠模型：SD大鼠40只，

6、隨機分為4組：正常組，假手術組，模型組，“雙固一通”組。在腦立體定位儀上，將6-OH DA 15μg(溶于3μl含0.2％維生素C的生理鹽水中)，注入大鼠一側(cè)紋狀體尾殼核，術后第6周后以阿樸嗎啡(apomorphine，APO)腹腔注射(0.5mg/kg)誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為，40min內(nèi)平均轉(zhuǎn)速超過7r/min者為造模成功。 2.“雙固一通”針刺治療方法：取關元、足三里、太沖、風府，28號1寸毫針針刺，接G6805A型電針治療儀，采用

7、斷續(xù)波，頻率為2Hz，每天1次，每次30分鐘，連續(xù)治療2周后取材。 3.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元含量的影響：以免疫組織化學方法檢測各組黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞和纖維的形態(tài)及數(shù)量。 4.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質(zhì)小膠質(zhì)細胞含量的影響：采用蓖麻凝集素標記小膠質(zhì)細胞。 5.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質(zhì)TNF-α和IL-1β含量的影響：運用抗細胞因子單克隆抗體測定法測定TNF

8、-α含量，運用免疫組織化學染色法檢測IL-1β。 6.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質(zhì)補體C1q和C9水平的影響，采用采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測。 7.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元Bcl-2 mRNA表達的影響：rt-PCR方法檢測Bcl-2 mRNA基因表達。 結果： 1.模型組損毀側(cè)黑質(zhì)致密部神經(jīng)元總數(shù)、TH陽性神經(jīng)元、神經(jīng)纖維數(shù)量顯著低于正常組和假手術組(P<0.01)，“雙固一

9、通”組與模型組比較各相應指標數(shù)值顯著增加(P<0.01)； 2.正常組和假手術組幾乎未見陽性小膠質(zhì)細胞，而雙固一通組的黑質(zhì)小膠質(zhì)細胞數(shù)量與模型組小膠質(zhì)細胞數(shù)量相比降低(P<0.05)； 3.與模型組、正常組和假手術組相比較，“雙固一通”組大鼠黑質(zhì)TNF-α和IL-1 β含量明顯降低(P<0.01)； 4.與模型組，正常組和假手術組相比較，“雙固一通”組大鼠黑質(zhì)補體C1q和C9含量明顯降低(P<0.01.)；

10、 5與對照組相比，Bcl-2 mRNA在模型組的黑質(zhì)內(nèi)表達活性有所下降，“雙固一通”組Bcl-2 mRNA的表達增高，與模型組相比有顯著差異(P<0.05)。 結論： 1.“雙固一通”針法可以提高神經(jīng)元總數(shù)、TH陽性神經(jīng)元數(shù)量，阻止神經(jīng)元進一步損傷； 2.“雙固一通”針法可以抑制PD大鼠黑質(zhì)異常增多的陽性小膠質(zhì)細胞數(shù)量； 3.PD大鼠TNF-α和IL-1β含量過高，“雙固一通”針法能降低二者含量，減少對