蠟蚧輪枝菌入侵蚧蟲(chóng)過(guò)程中胞外酶作用及提高酶活性的研究.pdf

1、蚧蟲(chóng)屬昆蟲(chóng)綱Insecta半翅目Hemiptera蚧總科Coccoidea，全世界記錄25科，7355種，絕大多數(shù)是農(nóng)林、果樹(shù)和花卉的重要害蟲(chóng)。蚧蟲(chóng)最大的特點(diǎn)是體壁具有多種泌蠟腺體，分泌大量蠟質(zhì)，對(duì)蟲(chóng)體起保護(hù)作用，化學(xué)防治困難。開(kāi)展生物防治是控制蚧蟲(chóng)的重要途徑，包括應(yīng)用天敵昆蟲(chóng)和病原微生物。利用病原微生物防治害蟲(chóng)具有可以人工擴(kuò)大培養(yǎng)菌種，制成生物制劑，進(jìn)行大面積應(yīng)用，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。蠟蚧輪枝菌Verticillium lecanii(

2、Zimm.)是一種蟲(chóng)生真菌，最早由Nivter發(fā)現(xiàn)寄生咖啡蠟蚧(Lecanii coffeae)，然而目前主要用于防治粉虱和蚜蟲(chóng)，防治蚧蟲(chóng)的報(bào)道卻極少。本研究采用從蚧蟲(chóng)和稻褐飛虱上分離出的蠟蚧輪枝菌兩菌株（No.V3.4504（來(lái)自蚧蟲(chóng)）和No.V3.4505（來(lái)自稻褐飛虱））侵染蚧蟲(chóng)，分析了入侵過(guò)程中蠟蚧輪枝菌蛋白質(zhì)酶和幾丁質(zhì)酶的作用機(jī)制;根據(jù)胞外酶的變化特點(diǎn)，比較了該菌對(duì)朝鮮毛球蚧、沙里院褐球蚧和日本龜蠟蚧侵染力的大小;研究了蚧蟲(chóng)蜜

3、露的化學(xué)成分及其對(duì)蠟蚧輪枝菌入侵蚧蟲(chóng)的影響，并探討了在培養(yǎng)基中加入蚧蟲(chóng)表皮和氨基酸對(duì)蠟蚧輪枝菌蛋白酶活性的調(diào)節(jié)作用。為利用蠟蚧輪枝菌防治蚧蟲(chóng)提供科學(xué)依據(jù)。
　　具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.蠟蚧輪枝菌對(duì)蚧蟲(chóng)的感染和兩種胞外酶的作用采用從蚧蟲(chóng)和稻褐飛虱上分離出的病原蠟蚧輪枝菌兩菌株為材料，用孢子懸浮液（濃度5×107孢子/mL）感染沙里院褐球蚧雌成蟲(chóng)，對(duì)染菌后蟲(chóng)體罹病癥狀觀察發(fā)現(xiàn)，從染菌到蚧蟲(chóng)死亡大約經(jīng)歷7天，染菌后第2天

4、在蟲(chóng)體表面蠟粉稀薄的位置開(kāi)始出現(xiàn)菌絲，5天后，蚧蟲(chóng)表面菌絲大量生長(zhǎng)，且交織在一起，蟲(chóng)體表皮開(kāi)始出現(xiàn)褶皺，收縮變小，7天后，菌絲層加厚，蟲(chóng)體表皮萎縮，開(kāi)始死亡。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，蟲(chóng)體腹面貼于樹(shù)皮，濕度比背面的大，孢子在體緣和腹面容易附著和萌發(fā)，在這兩個(gè)部位的菌絲比背面的多。通過(guò)顯微切片觀察，在該蚧蟲(chóng)體壁的外表皮、內(nèi)表皮和真皮層都發(fā)現(xiàn)了入侵的菌絲，說(shuō)明該菌已侵染成功。
　　以沙里院褐球蚧雌成蟲(chóng)表皮制備成培養(yǎng)基，培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌兩菌株No.V3.

5、4504和No.V3.4505，分別測(cè)定在培養(yǎng)過(guò)程中第1-8d兩菌株的蛋白酶與幾丁質(zhì)酶活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株No.V3.4504的蛋白酶活性在前6天連續(xù)上升，最大值為33.94±1.61U/g，然后降低;幾丁質(zhì)酶活性在前期維持在一個(gè)較低水平，第5天開(kāi)始增加，最大值為7.28±1.36U/g。菌株No.V3.4505的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性變化趨勢(shì)與No.V3.4504相似。說(shuō)明蛋白酶在菌絲侵染體壁的前期發(fā)揮作用，降解表皮中的蛋白質(zhì)，

6、使幾丁質(zhì)暴露，誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶的大量產(chǎn)生，分解幾丁質(zhì)。
　　2.蠟蚧輪枝菌對(duì)三種蚧蟲(chóng)侵染力大小的研究用朝鮮毛球蚧、沙里院褐球蚧和日本龜蠟蚧的表皮為培養(yǎng)基，培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌菌株No.V3.4504，測(cè)定了其蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn):以朝鮮毛球蚧表皮為培養(yǎng)基，菌的蛋白酶活在第1天為18.97±1.59U/g，沙里院褐球蚧表皮培養(yǎng)基的酶活為15.25±0.92U/g，它們的酶活都在第6天達(dá)到最大值，分別為34.58±1.01U/g和3

7、3.94±1.61U/g。但在日本龜蠟蚧表皮培養(yǎng)基上，其酶活的變化與前兩者不同，第1天僅為7.67±0.62U/g，然后持續(xù)增高至第7天，酶活性出現(xiàn)最大值34.30±0.48U/g，比前兩者推后了1天。朝鮮毛球蚧表皮培養(yǎng)基上菌的幾丁質(zhì)酶活性在第1天為7.23±0.67U/g，沙里院褐球蚧表皮培養(yǎng)基的幾丁質(zhì)酶活性僅為0.89±0.18U/g，而日本龜蠟蚧表皮培養(yǎng)基，幾丁質(zhì)酶活幾乎測(cè)不出來(lái);在后續(xù)7天的培養(yǎng)中，以朝鮮毛球蚧表皮上培養(yǎng)的菌的幾

8、丁質(zhì)酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩種。
　　對(duì)三種蚧蟲(chóng)表皮的成分分析結(jié)果顯示，在每2.5g表皮中朝鮮毛球蚧、沙里院褐球蚧和日本龜蠟蚧的蛋白質(zhì)含量分別是2.0 g、2.1g和1.8g，幾丁質(zhì)的含量分別為0.2g、0.1g和0.1g。這說(shuō)明蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性與蚧蟲(chóng)表皮中蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)的含量成正比。根據(jù)這兩種胞外酶的活性，認(rèn)為菌株No.V3.4504侵染三種蚧蟲(chóng)的能力順序是朝鮮毛球蚧＞沙里院褐球蚧＞日本龜蠟蚧。
　　3.蚧蟲(chóng)蜜露對(duì)蠟蚧輪枝

9、菌入侵的影響針對(duì)蚧蟲(chóng)取食過(guò)程中從肛門(mén)排泄蜜露的習(xí)性，對(duì)蘋(píng)果樹(shù)上沙里院褐球蚧排泄蜜露的特點(diǎn)作了觀察，采用化學(xué)分析和氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定了該蚧蟲(chóng)蜜露的化學(xué)成份，結(jié)果發(fā)現(xiàn):蜜露組分中可溶性糖占69％，水分占26％，并含有18種氨基酸。將蜜露稀釋為10％、20％、30％、40％、50％共5個(gè)濃度，培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌兩菌株，測(cè)定了它們的胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性。結(jié)果顯示，菌株No.V3.4504的蛋白酶活性在蜜露濃度為10％時(shí)有最大值，為4.45±

10、0.18U/mL，然后隨著蜜露濃度增加，蛋白酶活性呈下降趨勢(shì);而菌株No.V3.4505的蛋白酶活性在蜜露濃度為20％時(shí)出現(xiàn)最大值，為8.5±0.71U/mL，隨后，蛋白酶活性持續(xù)降低。
　　兩菌株No.V3.4504和No.V3.4505的幾丁質(zhì)酶的活性變化趨勢(shì)相同，都在蜜露濃度為10％時(shí)出現(xiàn)最大值，前者為0.144±0.012U/mL，后者為0.431±0.042U/mL，隨后其活性都隨蜜露濃度增加而降低。
　　上述結(jié)果

11、說(shuō)明兩個(gè)問(wèn)題，蜜露中高濃度糖對(duì)蛋白酶和幾丁質(zhì)酶的活性有抑制作用，因此在蚧蟲(chóng)分泌蜜露前期應(yīng)用蠟蚧輪枝菌會(huì)有好的效果;兩個(gè)菌株比較，菌株No.V3.4505更能適應(yīng)在蜜露上生存。
　　4.蠟蚧輪枝菌蛋白酶活性調(diào)節(jié)試驗(yàn)比較了基本培養(yǎng)基和加入蚧蟲(chóng)表皮的培養(yǎng)基對(duì)蠟蚧輪枝菌的蛋白酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中加入蚧蟲(chóng)表皮能提高蛋白酶的活性，菌株No.V3.4504增長(zhǎng)幅度在2倍-12倍之間，菌株No.V3.4505增長(zhǎng)幅度在2倍-3倍之間。

12、>　　同時(shí)試驗(yàn)了培養(yǎng)基中分別加入氨基酸Ala、Met、Gly、 Pro對(duì)蠟蚧輪枝菌兩菌株的蛋白酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):加入Met對(duì)蛋白酶的活性有提高作用，其中菌株No.V3.4504的增長(zhǎng)了256.9％，菌株No.V3.4505增長(zhǎng)了215.7％。
　　通過(guò)在液體培養(yǎng)基中加入不同量Met，培養(yǎng)菌株No.V3.4504，發(fā)現(xiàn)Met在0.25％和0.5％兩個(gè)濃度下對(duì)該菌的蛋白酶的活性有極顯著促進(jìn)作用。說(shuō)明Met作為調(diào)節(jié)劑，有一定的濃度