高糖作用的腎系膜細(xì)胞ERK1-2、MKP-1蛋白表達(dá)的泛素化調(diào)節(jié)研究.pdf

1、目的:糖尿病腎病(DN)是糖尿病最嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，一般研究認(rèn)為20％～30％的糖尿病患者發(fā)生DN。DN早期的病變特點(diǎn)為腎小球基底膜的增厚以及細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的增生，從而導(dǎo)致腎小球的高濾過和微量白蛋白尿。系膜細(xì)胞是眾多致病因子作用的主要靶細(xì)胞，在DN發(fā)病中起著重要作用。嚴(yán)格的控制血糖、血壓以及血脂可以減少DN發(fā)生的危險(xiǎn)性，但仍然不能完全阻止糖尿病患者從早期DN進(jìn)展至終末期腎病(ESRD)。DN的發(fā)病機(jī)制不清，研究證實(shí)，遺傳、糖代謝、

2、血流動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞因子等多種機(jī)制參與了DN的發(fā)生。在這些機(jī)制中，目前認(rèn)為氧化應(yīng)激可能是糖尿病腎病發(fā)生的共同機(jī)制，高血糖所致各代謝途經(jīng)異常均伴有氧化應(yīng)激的增加，最終均通過激活一些重要信號(hào)分子如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)造成腎臟損害。MAPK是體內(nèi)致絲裂原細(xì)胞增生的重要信號(hào)分子，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶ERK1/2(即P42/44MAPK)是MAPK家族中最具代表性的蛋白激酶，絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)則是MAPK通路重要的負(fù)性調(diào)節(jié)分子

3、，可以通過脫磷酸化抑制MAPK信號(hào)的放大。泛素一蛋白酶體途徑(UPP)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的重要的特異性降解途徑，最近研究提示MKP-1對(duì)ERK1/2脫磷酸化和滅活的蛋白水解作用是通過UPP來完成的。糖尿病時(shí)UPP如何調(diào)節(jié)ERK1/2、MKP-1的表達(dá)，如何參與DN的發(fā)病，目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。為明確ERK1/2、MKP-1在DN時(shí)的變化以及UPP在糖尿病ERK信號(hào)中的作用，本研究觀察了高糖刺激后大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMC)胞內(nèi)信

4、號(hào)蛋白ERK1/2和MKP-1的表達(dá)，并以蛋白酶體特異性抑制劑MG132作為泛素一蛋白酶體途徑阻斷劑，初步探討了泛素化降解MAPK信號(hào)蛋白在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中的作用，為DN的防治尋求新的理論依據(jù)。方法:大鼠HBZY-1腎小球系膜細(xì)胞株分為8組，將高糖作為刺激因子，MG132作為干預(yù)因素。分別設(shè)血糖正常組(5.6mmol/L)，高糖組(包括三種濃度的葡萄糖:10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、甘露醇組(24.4mmol

5、/L甘露醇作為滲透壓對(duì)照)、血糖正常(5.6mmol/L)加MGl32(1μmol/L)組、高糖(20mmol/L、30mmol/L)加MGl32(1gmol/L)組。用MTT法檢測高糖和不同濃度的MG132對(duì)HBZY-1細(xì)胞增殖情況影響并繪制細(xì)胞生長曲線；用蛋白免疫印跡法檢測各組系膜細(xì)胞ERK1/2、MKP-1的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光染色法及激光共聚焦顯微鏡檢測各組系膜細(xì)胞ERKl/2的表達(dá)、轉(zhuǎn)位。 結(jié)果:1、在高糖培養(yǎng)的48h以

6、內(nèi)，低濃度MGl32(≤1umol/L)和30mmol/L，的高糖對(duì)細(xì)胞生長無明顯抑制作用，MG132濃度>1umol/L，時(shí)，隨著濃度的增加，MGl32對(duì)細(xì)胞抑制作用明顯增強(qiáng)；對(duì)于同一濃度(＞1umol/L)的MGl32而言，隨著作用時(shí)間的延長抑制率升高。2、正常組系膜細(xì)胞可表達(dá)ERK1/2，甘露醇組系膜細(xì)胞ERK1/2較正常血糖組均無明顯變化(P＞0.05)，高糖組系膜細(xì)胞ERK1/2表達(dá)較正常血糖組均增多(P<0.05)，還可促進(jìn)

7、ERK1/2由胞漿向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)位、激活，而且具有濃度依賴性，高糖組加入MG132后，系膜細(xì)胞ERK1/2表達(dá)和轉(zhuǎn)位、激活均減弱。3、正常組系膜細(xì)胞可表達(dá)MKP-1，甘露醇組系膜細(xì)胞MKP-1較正常糖組無明顯變化(P>0.05)，高糖組系膜細(xì)胞:MKP-1表達(dá)較正常血糖組均減少(P<0.05)，而且具有濃度依賴性，高糖組加入:MG132后，系膜胞MKP-1表達(dá)均增多。結(jié)論:1、高糖可誘導(dǎo)腎系膜細(xì)胞ERK1/2表達(dá)增強(qiáng)和ERK1/2由胞漿向胞