小麥及其近緣植物NPR1類似基因和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因片段的分離和特性分析.pdf

1、本研究從白粉病菌誘導(dǎo)的小麥中分離到具有活性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，可為植物基因分離和功能鑒定提供有力的工具。取得以下研究進展： 1.根據(jù)已克隆的其它植物的NPR1基因的保守序列設(shè)計引物，從白粉病菌誘導(dǎo)的中間偃麥草和粗山羊草中獲得了NPR1類似基因片段，具有ANK結(jié)構(gòu)保守序列，這兩個基因分別命名為TiNH1和AsNH2。根據(jù)獲得的TiNH1基因片段的序列設(shè)計RACE引物，通過RACE法獲得了TiNH1的全長基因cDNA序列，同時從粗山羊草

2、和普通小麥分別獲得了NPR1類似基因的全長序列，分別命名為AsNH1和TaNH1。對TiNH1、TaNH1、AsNH1和AsNH2的序列比較發(fā)現(xiàn)：TiNH1、TaNH1和AsNH1編碼蛋白的氨基酸之間的同源性在98％以上，它們存在垂直同源的關(guān)系；而它們與AsNH2的同源性僅84％，說明TiNH1、TaNH1和AsNH1與AsNH2是不同類型的NPR1類似基因。由此，推測中間偃麥草和粗山羊草里可能還存在其它NPR1類似序列。 2.

3、通過序列分析發(fā)現(xiàn)：TiNH1、TaNH1和AsNH1推導(dǎo)的蛋白質(zhì)都具有已知NPR1蛋白的典型保守結(jié)構(gòu)域POZ/BTB和ANK。對已報道的擬南芥、煙草、小麥、玉米的NPR1與TiNH1，TaNH1和AsNH1的氨基酸序列進行分析，結(jié)果表明：對NPR1功能起關(guān)鍵作用的氨基酸在不同物種不同基因產(chǎn)物間均具有保守性，如npr1-1(H)、npr1-2(C)和nim1-4(R)。TiNH1、TaNH1和AsNH1基因的5’端GC含量高達70％以上。

4、進化樹分析表明：TiNH1、TaNH1和AsNH1與水稻NPR1(Genbankaccession:NM189701.1)關(guān)系密切，與美國專利報道的小麥NPR1同源序列(Patentnumber：WO0070069)關(guān)系較遠，說明小麥中可能存在多個NPR1或類似基因序列。 3.以TiNH1作為探針，與不同病原處理的中間偃麥草總RNA進行Northern雜交分析，結(jié)果表明：TiNH1正常情況下有微量表達，但在小麥白粉病菌(Blum

5、eriagraminis)誘導(dǎo)下表達增強，以白粉病菌誘導(dǎo)10小時到24小時表達量最高。在小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)誘導(dǎo)情況下TiNH1基因表達量也增加，紋枯病菌誘導(dǎo)5小時TiNH1表達水平最高，然后表達量又降低，這些結(jié)果說明：TiNH1介導(dǎo)對白粉病、紋枯病的抗性調(diào)控反應(yīng)，TiNH1的表達模式有所不同。 4.為了解TiNH1在中間偃麥草基因組中的存在形式，以TiNH1為探針與Darl，BamHI限制內(nèi)切

6、酶消化的中間偃麥草基因組DNA進行Southern雜交分析。結(jié)果表明：TiNH1以單拷貝的形式存在于中間偃麥草基因組中。 5.利用瞬間表達技術(shù)初步分析了TiNH1基因的功能：首先構(gòu)建了TiNH1基因的高效表達載體，然后使用基因槍將TiNH1基因和GUS基因的載體共轟擊導(dǎo)入到感白粉病小麥品種中8601離體葉片表皮細胞中，用GUS基因標(biāo)記陽性轉(zhuǎn)化細胞。轉(zhuǎn)化后4h接種白粉菌孢子，44h后觀察轉(zhuǎn)化陽性表皮細胞，研究TiNH1基因表達對白

7、粉菌入侵及吸器形成產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，TiNH1在中8601葉片表皮細胞中能夠瞬間表達，對白粉病菌的侵入和吸器形成均有部分抑制作用，在一定程度上增強了對白粉菌的抗性。 6.本研究探討了小麥反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的活化模式，發(fā)現(xiàn)SA、JA和小麥白粉病菌防御相關(guān)的脅迫可以激活小麥反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。利用接種白粉病菌的抗病易位系小麥Pm97034的總RNA，通過RT-PCR擴增，克隆了51反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的反轉(zhuǎn)錄酶片段，發(fā)現(xiàn)3個新的小麥反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族

8、family8-10。Matsuoka和Tsunewaki(1996)推測小麥及其近緣屬中的family4反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有活性。為了明確family4是否具有轉(zhuǎn)錄活性，從family4中隨意選擇RT20作為探針，與用防御相關(guān)脅迫如JA、SA和病原菌處理過的Pm97034的總RNA雜交。結(jié)果表明，RT20在正常情況下有低水平的表達，但在JA、SA和病原菌誘導(dǎo)下，表達水平明顯增強，24h處理后達到高峰，48h后恢復(fù)到正常的水平。說明fami

9、ly4的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有轉(zhuǎn)錄活性。Southern分析結(jié)果表明RT20以高拷貝的形式存在于小麥及其近緣屬基因組中。表明了這種轉(zhuǎn)錄激活方式可能是小麥反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族的共同特征。 綜合上述，本研究從白粉病菌誘導(dǎo)的小麥及其近緣植物中分離克隆出的NPR1類似基因和小麥反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子保守片段，并對它們的生物學(xué)特性和功能進行了分析。TiNH1在一定程度上增強了表達細胞對白粉病菌的抗性。從小麥及其近緣屬中克隆的NPR1類似基因?qū)沂究共∽饔脵C制