ALA-PDT對人增生性疤痕成纖維細胞的作用.pdf

1、目的：成纖維細胞增殖和局部微血管異常增生是增生性疤痕的主要病理特征，現(xiàn)有非手術(shù)治療手段通常通過抑制成纖維細胞增殖或抑制血管增生達到治療目的。光動力學治療已被證實在抑制腫瘤細胞增殖、破壞局部血管網(wǎng)方面療效確實。因此，我們提出了應用光動力學治療增生性瘢痕的設(shè)想，探討了5-氨基酮戊酸（5-ALA）介導的光動力治療（PDT）對體外培養(yǎng)的人增生性疤痕成纖維細胞的殺傷作用，為動物體內(nèi)試驗及將來的臨床應用提供依據(jù)。 方法：①收集臨床增生性疤痕

2、和正常皮膚標本，常規(guī)酶消化法分離獲得成纖維細胞，體外培養(yǎng)擴增。取第4-6代成纖維細胞，在含有和不含有血清的培養(yǎng)液中添加ALA培養(yǎng)，孵育4小時后通過光鏡觀察細胞形態(tài)，激光共聚焦檢測細胞內(nèi)ALA代謝中間產(chǎn)物原卟啉IX（Protoporphyrin IX，PpIX）的積聚，并做熒光強度定量分析，探討ALA是否能被成纖維細胞吸收并產(chǎn)生PpIX的積聚，及培養(yǎng)液中血清對細胞內(nèi)PpIX積聚的影響。②用635nm波長的激光照射，總能量選擇10J/cm2

3、，功率密度選擇100mw/cm2、10mw/cm2,光鏡觀察治療前后細胞形態(tài)變化，MTT法檢測處理24小時后的細胞存活率，探討PDT對瘢痕成纖維細胞的殺傷作用。③采用相同的功率密度（100mw/cm2）不同的總能量（0-10 J/cm2）進行照光處理，光鏡觀察細胞形態(tài)變化，TUNEL染色確認細胞死亡方式，AnnexinV/PI雙染后流式細胞儀分析，檢測細胞發(fā)生凋亡和壞死的比率，探討不同照光條件對細胞殺傷的作用方式。 結(jié)果：⑴在無

4、血清培養(yǎng)條件下，ALA處理后4小時，成纖維細胞產(chǎn)生皺縮，而未處理組無明顯形態(tài)學變化；在有血清條件下，ALA處理組未處理組均未見明顯形態(tài)改變。激光共聚焦檢測可見ALA處理4小時后無血清培養(yǎng)組細胞內(nèi)有明顯的PpIX積聚，而有血清組PpIX的熒光強度較無血清組弱。⑵10J/cm2能量照光后，無血清培養(yǎng)條件，ALA處理組細胞24H內(nèi)漂浮壞死，MTT檢測生存率為11％-69％，與未用ALA處理組存在顯著差異。有血清條件下，ALA處理組與未處理組無

5、顯著差異。⑶在低能量2J/cm2-4J/cm2激光照射下，部分細胞TUNEL染色呈陽性，而在高能量照射時，細胞TUNEL染色呈陰性。AnnexinV/PI雙染后流式細胞儀分析顯示低能量激光照射時，約有3.6％-15.6％的細胞發(fā)生凋亡，而能量加大到10J/cm2時大部分細胞發(fā)生壞死。 結(jié)論：①人增生性疤痕成纖維細胞經(jīng)外源性ALA處理后，可產(chǎn)生PpIX的積聚，血清降低PpIX的積聚。②ALA-PDT對成纖維細胞有殺傷作用。③低能量