硫化氫促進不同缺血模型的血管新生及其機制研究.pdf

1、硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是一種無色、有臭雞蛋氣味的氣體。長時間以來，它被認定為是一種有毒的氣體，大量吸入會導(dǎo)致中毒，其毒性作用主要通過抑制線粒體的細胞色素C氧化酶，影響呼吸鏈的活動，從而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的活動。直到1989年，人們在大鼠和人腦中檢測到了內(nèi)源性H2S，以及接下來發(fā)現(xiàn)的催化它產(chǎn)生的三種酶，說明H2S可能具有一定的生理作用。越來越多的研究表明，H2S在機體內(nèi)的各個系統(tǒng)中都發(fā)揮著非常重要的作用

2、。在神經(jīng)系統(tǒng)中，H2S既可以作為神經(jīng)調(diào)節(jié)因子對神經(jīng)系統(tǒng)的功能進行調(diào)控，也可以作為神經(jīng)保護因子對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮其保護效應(yīng)。神經(jīng)元中，它可以增強NMDA受體活性，易化長時程動作電位的產(chǎn)生，對記憶過程產(chǎn)生影響。在心血管系統(tǒng)中，H2S通過開放血管平滑肌細胞上ATP敏感的鉀通道（KATP通道），引起血管平滑肌細胞舒張，降低血壓。在缺血再灌注模型中，它可以減小心梗面積，改善心梗后左心室功能。消化系統(tǒng)中，H2S可以促進脂肪細胞和骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取

3、，增加葡萄糖耐量和胰島素敏感性。鑒于H2S對身體各個系統(tǒng)的重要的調(diào)節(jié)作用，還有它是一種小分子量的氣體分子，能穿透細胞膜直接起效，在體內(nèi)產(chǎn)生并受內(nèi)源性關(guān)鍵酶的調(diào)節(jié)，生理濃度時有明確的功能并能被外源性氣體模擬，H2S成為繼一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后的第三個氣體信號分子。
　　血管新生是指在原有血管的基礎(chǔ)上通過血管外基質(zhì)降解，血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移形成子代血管支并具有

4、血運功能的一個過程。它可發(fā)生于組織生長發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)和腫瘤生長等多種生理、病理過程中。在血管新生方面，我課題組于2007年在國際上首次發(fā)現(xiàn)外源性H2S具有顯著的促血管新生作用。它不僅可以促進內(nèi)皮細胞的增殖，遷移和管腔形成，還可以在小鼠Matrigel Plug動物模型上促進血管的新生。隨后Szabo C等在雞胚絨毛膜尿囊(CAM)模型中也證實了H2S的促血管新生效應(yīng)。
　　缺血性疾病是一種臨床上常見的高致殘率、高致死率的疾病，它是

5、由病理或者外界損傷導(dǎo)致機體動脈或者靜脈血流急劇降低或中斷，使得該血管的血供區(qū)失去氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供給造成的。傳統(tǒng)的缺血性疾病的治療方法側(cè)重于血管的再通，而忽略了血管再灌時對微循環(huán)的傷害，于是誕生了治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)。它是指將外源性血管新生誘導(dǎo)因子（如VEGF、bFGF）或其基因片段或干細胞轉(zhuǎn)入缺血組織中，增強缺血區(qū)的側(cè)支毛細血管新生，改善缺血區(qū)的血流，促進缺血區(qū)血供恢復(fù)。正常生理狀態(tài)下，H

6、2S可以明顯地促進血管新生，在疾病狀態(tài)，如組織缺血時，H2S是否也能促進血管新生，以及促進缺血組織血管新生的機制是什么，具有重要的研究價值。因此在本文中，我們將重點探討H2S在不同缺血模型中的促血管新生作用及其作用機制，為治療性血管新生提供新的策略。
　　首先，我們觀察了外源性NaHS腹腔注射連續(xù)4W對大鼠缺血下肢血管新生的影響。熒光微球法測血流結(jié)果顯示，NaHS20和50μmol/kg/day腹腔注射連續(xù)4W，能夠顯著改善缺血下

7、肢的血流供應(yīng);血管造影發(fā)現(xiàn)，NaHS50和100μmol/kg/day慢性給藥組的側(cè)枝血管形成最多;免疫組化結(jié)果表明各濃度的NaHS處理組能夠不同程度地促進缺血下肢微血管的生成，以NaHS50μmol/kg/day處理組效果最為顯著;50μmol/kg/day的NaHS慢性給藥組還能夠顯著提高增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，PCNA)在兩種細胞上的表達，促進內(nèi)皮細胞和骨骼肌細胞的增殖

8、;在缺血下肢中，血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）主要表達在骨骼肌細胞上，且不同劑量的NaHS腹腔注射連續(xù)4W，能夠不同程度地提高VEGF的表達;而VEGF受體2型(vascular endothelial growth factor receptor2,VEGFR2)和phospho-VEGFR2主要表達在內(nèi)皮細胞上，NaHS不改變VEGFR2的表達量，但是能夠顯著增強VE

9、GFR2的磷酸化;而且NaHS也能夠提高缺血組織中Akt的磷酸化水平。以上結(jié)果說明，NaHS確實能夠促進大鼠缺血下肢的血管新生，改善缺血區(qū)的血供，該作用可能和促進缺血區(qū)骨骼肌細胞中VEGF的表達以及內(nèi)皮細胞中VEGFR2的磷酸化有關(guān)。
　　其次，我們成功建立了小鼠的心梗模型。并利用心電圖(electrocardiogram，ECG)、心超、Evans'Blue-TTC染色和蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosinst

10、aining，HE染色）等技術(shù)，驗證心梗模型是否成功。心梗手術(shù)后，小鼠心臟前壁變白，心跳減緩;ECG顯示，ST段（J點）抬高，呈現(xiàn)缺血性變化;心超結(jié)果顯示，與sham組相比，手術(shù)組EF和FS值明顯降低;心肌酶譜檢測結(jié)果顯示，血漿中LDH、CK和CK-MB含量升高;Evans'Blue-TTC染色可以明顯地看到變白的梗死區(qū)域;HE染色可以看到心梗后2W，梗死區(qū)被大量纖維組織代替。以上檢測手段都說明，小鼠心梗模型建立成功。
　　再次，

11、我們在成功建立的小鼠心梗模型的基礎(chǔ)上，觀察了H2S對小鼠心梗后血管新生情況和心肌保護作用。免疫組化結(jié)果表明，NaHS50μmol/kg/day腹腔注射2W能夠促進心臟危險區(qū)微血管的形成，緩解缺血導(dǎo)致的心功能損傷;而且不同劑量的NaHS腹腔注射4W都能降低小鼠的死亡率，尤其以NaHS50μmol/kg/day給藥組小鼠的死亡率最低;ELISA的結(jié)果顯示，外源性H2S處理并不改變?nèi)毖募〗M織中VEGF的含量;卻顯著增加CSE、CBS和3-M

12、ST的蛋白表達，并且升高血漿中H2S的含量。、
　　接下來，我們利用CSE基因敲除的小鼠，初步觀察了內(nèi)源性H2S在促血管新生中的作用。結(jié)果顯示，CSE基因敲除小鼠心梗后，微血管形成數(shù)量更少;此時，雖然CBS和3-MST蛋白表達明顯升高，但是血漿中H2S含量更低;同時，心梗后組織中VEGF的含量明顯降低。以上結(jié)果說明了內(nèi)源性H2S在心梗后血管新生中也起到一定的作用。最后，我們利用培養(yǎng)的原代心肌細胞，觀察了H2S對缺氧下心肌細胞的保護

13、作用。LDH和CCK8檢測結(jié)果顯示，缺氧6h后，心肌細胞損傷嚴(yán)重，細胞活力降低;NaHS處理能夠明顯改善這種狀況;western blot和ELISA的結(jié)果顯示，缺氧后心肌細胞VEGF表達和分泌都升高，但是NaHS并不影響VEGF的表達和分泌;缺氧后心肌細胞內(nèi)CSE和3-MST蛋白表達不變，CBS蛋白表達明顯升高;NaHS處理升高CBS的表達，但是不影響CSE和3-MST的表達。同時，HPLC-MS檢測結(jié)果顯示，缺氧時心肌細胞培液中H2

14、S含量降低，NaHS處理后能夠升高培液中H2S的含量。利用CSE SiRNA敲低CSE的表達后，CSE蛋白表達降低，同時培液中H2S含量明顯降低;LDH和CCK8檢測結(jié)果顯示，細胞損傷更加嚴(yán)重，說明內(nèi)源性的H2S在保護缺氧心肌細胞中的作用。
　　綜上所述，本文通過以上一些列實驗發(fā)現(xiàn)H2S可以促進大鼠缺血下肢的血管新生，該作用可能和VEGF介導(dǎo)的旁分泌作用有關(guān);H2S可以促進小鼠心梗后的血管新生，緩解缺血對心臟的損傷，該作用可能和三