周期性牽張誘導膀胱逼尿肌細胞高表達Cx43的實驗研究.pdf

1、背景及目的：逼尿肌不穩(wěn)定(Detrusorinstability，DI)是一種常見的膀胱功能障礙，可引起尿頻、尿急、緊迫性尿失禁等臨床癥狀，嚴重者還將引起腎、輸尿管積水和腎功能損害，嚴重影響人們的身體健康。DI的臨床發(fā)病率高，療效不理想，主要原因是其發(fā)生機理尚不清楚。 研究顯示，DI逼尿肌細胞間縫隙連接(Gapjunction，GJ)顯著增加；縫隙連接蛋白表達以Connexin43(Cx43)增加為主?？p隙連接是相鄰細胞間電耦聯(lián)

2、的媒介及離子交換的低阻力膜通道，它允許分子量小于1.0-1.5KD或直徑小于1.0nm的小分子物質(zhì)如離子、第二信使、Ca2++、cAMP、cGMP等直接通過，使這些物質(zhì)能在相鄰細胞間快速傳遞。因此，縫隙連接增加可使小分子物質(zhì)容易通過縫隙連接在細胞間擴散，從而導致逼尿肌細胞膜去極化，逼尿肌易發(fā)生收縮而導致逼尿肌不穩(wěn)定。但是目前尚不清楚促使Cx43高表達的機制。 綜合文獻資料，DI往往是由膀胱出口梗阻(Bladderoutletob

3、struction，BOO)引起的。但是，BOO是如何導致DI呢?其具體途徑不清楚。我們設(shè)想，膀胱出口梗阻導致膀胱代償性肥大、擴張，結(jié)構(gòu)的改變導致功能的改變；那么，逼尿肌細胞受到周期性牽張刺激可能是DI發(fā)生的觸發(fā)器。而我們前期研究也已經(jīng)證實，運用周期性牽張逼尿肌細胞體外模型可以很好地模擬梗阻后膀胱過度膨脹狀態(tài)。因此，我們應(yīng)用該模型來探討周期性牽張刺激對膀胱逼尿肌細胞Cx43表達的改變及其可能機制。 本課題主要從以下幾個方面對逼尿

4、肌細胞進行研究。第一，建立周期性牽張膀胱逼尿肌細胞模型，并在此基礎(chǔ)上觀察牽張刺激對膀胱逼尿肌細胞連接蛋白Cx43表達的影響。第二，用EGTA鰲合細胞外游離Ca2+，觀察牽張誘導Cx43表達改變對Ca2+的依賴性。第三，牽張前用不同的鈣通道抑制劑抑制鈣通道，然后再予以牽張刺激，觀察逼尿肌細胞胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度([Ca2+]i)的改變，探討Ca2+信號在牽張刺激誘導Cx43表達改變中的作用。 方法：采用膠原酶消化法常規(guī)分離培養(yǎng)S

5、D大鼠逼尿肌細胞，并將細胞接種在彈性底部的培養(yǎng)皿上，對其施加周期性張力負荷，建立起周期性牽張膀胱逼尿肌細胞體外模型。應(yīng)用半定量RT-PCR及WesternBlotting等方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測逼尿肌細胞連接蛋白Cx43基因及其蛋白的表達變化。采用激光共聚焦顯微鏡法，測定EGTA及不同鈣通道拮抗劑作用條件下，細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的改變，揭示不同的鈣通道在牽張刺激誘導Cx43表達改變中的作用。 結(jié)果：主要研究結(jié)果如下：

6、1.成功建立了周期性牽張膀胱逼尿肌細胞體外模型，為下一步實驗奠定了基礎(chǔ)； 2.周期性牽張刺激可以誘導逼尿肌細胞Cx43基因表達顯著增加，與正常對照組相比較有非常顯著性差異(P＜0.01)； 3.周期性牽張刺激可以誘導逼尿肌細胞Cx43蛋白表達顯著增加，與正常對照組相比較具有非常顯著性差異(P＜0.01)； 4.牽張前用EGTA鰲合細胞外游離Ca2+，再給予細胞牽張刺激，則細胞Cx43mRNA表達與正常對照組比較無

7、明顯差異(P＞0.05)，與單純牽張組比較相差非常顯著(P＜0.01)； 5.牽張刺激可以顯著增加[Ca2+]i，EGTA可以完全抑制牽張誘導的[Ca2+]i增加，氯化釓、硝苯地平、蘭尼堿與毒胡蘿卜素可分別抑制61.95％、29.98％、87.98％由牽張刺激誘導的[Ca2+]i增加。 結(jié)論：主要結(jié)論如下： 1.周期性牽張逼尿肌細胞體外模型是模擬梗阻后膀胱過度擴張狀態(tài)的有效的研究手段； 2.周期性牽張刺激

8、可以誘導逼尿肌細胞Cx43在基因水平表達較正常對照組明顯增加； 3.周期性牽張刺激可以誘導逼尿肌細胞Cx43在蛋白水平表達較正常對照組明顯增加； 4.梗阻后逼尿肌細胞受到的周期性牽張刺激可能是DI發(fā)生的觸發(fā)器； 5.牽張刺激誘導Cx43表達增加是Ca2+依賴性的，牽張誘導的細胞外Ca2+的內(nèi)流可能是這一反應(yīng)的初始刺激因素； 6.牽張激活離子通道在周期性牽張誘導膀胱逼尿肌細胞Cx43表達增加反應(yīng)中可能起著較