RNAi抑制食管癌細(xì)胞系ECA109端粒酶活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、端粒是真核細(xì)胞線性染色體末端特殊的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，有維持染色體穩(wěn)定和基因組完整的功能，隨細(xì)胞的分裂不斷縮短，直至染色體丟失、融合、重組和降解，發(fā)生細(xì)胞凋亡，因而被稱為細(xì)胞分裂的“生物鐘”。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，能以自身的RNA為模板合成端粒的DNA重復(fù)序列(5-TTAGGG-3)n加在染色體末端，維持端粒長度，使細(xì)胞發(fā)生永生化或變成癌細(xì)胞。端粒酶在85％以上的惡性腫瘤組織中陽性表達(dá)，而在正常體細(xì)胞中則一般為陰性。把端粒酶作為腫

2、瘤治療的靶點(diǎn)具有良好的應(yīng)用前景。目前研究認(rèn)為人端粒酶復(fù)合體主要由人端粒酶RNA(human telomeraseRNA,hTR)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reversetranscriptase,hTERT)組成。最近研究報(bào)道hTERT既是影響端粒酶活性的最重要部分，也是端粒酶活性的限速因子。因此，靶向hTERT顯然更為理想。其中重要的方法有反義核酸技術(shù)封閉、錘頭狀核酶切割和抑制hTERT的轉(zhuǎn)錄等。RNA干擾

3、(RNA interference,RNAi)是指由特定雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。研究表明，Dicer核酸酶(Dicer RNase L)斷裂dsRNA產(chǎn)生的小干涉RNA可以抑制哺乳動(dòng)物體細(xì)胞和胚胎中的基因的表達(dá)。RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNApolymerase，RdRP)在擴(kuò)增RNAi中起著關(guān)鍵性的作用，RdRP活性復(fù)制較長觸發(fā)性dsRNA

4、或以一種非引物的方式復(fù)制小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)，即以siRNA為引物的RdRP反應(yīng)使靶mRNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA，同時(shí)復(fù)制觸發(fā)性dsRNA。所有的產(chǎn)物又可作為Dicer的底物，起始RdRP級(jí)聯(lián)反應(yīng)。 目的：研究載體介導(dǎo)RNAi技術(shù)對(duì)食管癌細(xì)胞系ECA109端粒酶及hTERT mRNA表達(dá)的抑制作用，探討RNAi抑制腫瘤細(xì)胞的作用及機(jī)理。 方法：根據(jù)Gene bank中報(bào)道的h

5、TERT的核苷酸序列，參考siRNA的設(shè)計(jì)策略，通過基因blast，挑選3條目的hTERT基因的siRNA序列：Ⅰ：TTGCAAAGCATTGGAATCA，Ⅱ：AGAACGTTCCGCAGAGAA，Ⅲ：GTACAGGTTTCACGCATGT構(gòu)建干擾質(zhì)粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及空質(zhì)粒，并將其分別轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞系ECA109，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果；24h、48h末端重復(fù)片斷擴(kuò)增．酶聯(lián)免疫吸附(TRAP-ELJSA)方法測定細(xì)胞端粒酶活性，篩選出高效抑

6、制端粒酶活性的hTERT siRNA，RT-PCR觀察ECA109細(xì)胞中hTERT mRNA表達(dá)改變。 結(jié)果：1重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒酶切鑒定：經(jīng)BamH Ⅰ和HindⅢ酶切后干擾質(zhì)粒插入片段為110bp左右，空質(zhì)粒插入片段為70bp左右。 2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h、48h后熒光顯微鏡觀察各轉(zhuǎn)染組均見有綠色熒光的細(xì)胞，約占細(xì)胞總數(shù)的50％-60％。 3 端粒酶活性測定：干擾質(zhì)粒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECA109細(xì)胞后端粒

7、酶活性數(shù)值：24h端粒酶活性均數(shù)依次為：0.417±0.023，0.189±0.025，0.435±0.034與對(duì)照組均數(shù)0.879±0.036比較，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均有顯著性差異(P<0.05)。48h端粒酶活性均數(shù)依次為：0.435±0.032，0.177±0.020，0.395±0.021與對(duì)照組均數(shù)0.847±0.027比較，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組均有顯著性差異(P<0.05)。各干擾質(zhì)粒的抑制率：48h各干擾質(zhì)粒的抑制率：干擾組Ⅰ抑制率=49

8、％，干擾組Ⅱ抑制率=79％，干擾組Ⅲ抑制率=53％，Ⅱ組抑制率最高。 4 半定量RT-PCR結(jié)果4.1 RNA電泳結(jié)果：顯示18s，28s條帶完整、清晰，28s帶的寬度及亮度約是18s的2倍左右。 4.2 hTERT和β-actin的擴(kuò)增基因經(jīng)電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增片段大小與所設(shè)計(jì)的大小完全一致，分別為198 bp和621bp，重組質(zhì)粒Ⅱ轉(zhuǎn)染的ECA109中hTERT-mRNA的表達(dá)較空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的ECA109中hTERT-mRNA表

9、達(dá)量顯著下降，hTERT擴(kuò)增產(chǎn)物強(qiáng)度與內(nèi)對(duì)照β-actin的比值在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別為0.9323±0.0155，0.5167±0.01922，有顯著性差異(P<0.01，n=4)。實(shí)驗(yàn)組降低為對(duì)照組的55.4％。 結(jié)論：成功構(gòu)建載體介導(dǎo)的hTERT靶向RNA干擾重組體，能有效抑制食管癌細(xì)胞系ECA109端粒酶活性及hTERT-mRNA表達(dá)，確定特異性抑制端粒酶活性的siRNA靶點(diǎn)，為進(jìn)一步開發(fā)抗腫瘤新藥和基因治療提供試驗(yàn)和理論