微小RNA-let-7a對(duì)黑素瘤細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、皮膚惡性黑素瘤起源于黑素細(xì)胞，致死率高，轉(zhuǎn)移后無有效療法。miRNAs是一類新發(fā)現(xiàn)的在腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用的小分子RNA。本課題研究miRNA-let-7a在皮膚黑素瘤發(fā)病機(jī)制中的作用，尋找皮膚黑素瘤新的早期診斷標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。
　　 目的
　　 研究 miRNA-let-7a在福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）的皮膚黑素瘤組織和黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中的表達(dá)，探討miRNA-let-7a對(duì)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375細(xì)

2、胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制；研究BRAF蛋白在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和原代黑素細(xì)胞的表達(dá)差異，探索miRNA-let-7a對(duì)黑素瘤發(fā)病中關(guān)鍵蛋白BRAF的作用。
　　 方法：
　　 選取福爾馬林固定石蠟包埋的黑素瘤組織13例，先天性色素痣組織10例，培養(yǎng)黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和原代黑素細(xì)胞，分別采用High Pure miRNA Isolation試劑盒和RNAiso Plus抽提miRNA及總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，

3、用Taqman MGB探針和相應(yīng)的引物，在ABI Prism7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。對(duì)SDS軟件生成的數(shù)值進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)BRAF蛋白在黑素瘤細(xì)胞系.A375及原代黑素細(xì)胞的表達(dá)差異。
　　 應(yīng)用cy3標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染.A375細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。利用hsa-let-7a的模擬物及其陰性對(duì)照分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375，CCK-8實(shí)驗(yàn)計(jì)算轉(zhuǎn)染后兩

4、組細(xì)胞增殖的差異，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞凋亡的不同，免疫印跡實(shí)驗(yàn)分析兩組細(xì)胞Caspase-3（半胱天冬酶-3）蛋白和BRAF蛋白的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：
　　 從福爾馬林固定石蠟包埋的組織中成功抽提出miRNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示miRNA-let-7a在FFPE黑素瘤組織中的表達(dá)明顯低于色素痣組織（P<0.05），在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中的表達(dá)明顯低于原代黑素細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察可見siRNA的轉(zhuǎn)染效率約

5、80～90％。與陰性對(duì)照相比，50nM的hsa-let-7a模擬物轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞后，miRNA-let-7a的表達(dá)升高2.067倍。采用miRNA-let-7a的模擬物轉(zhuǎn)染后，與陰性對(duì)照相比，A375細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞凋亡增加（P<0.05）。與黑素細(xì)胞相比，BRAF蛋白在黑素瘤A375細(xì)胞系表達(dá)升高；與陰性對(duì)照相比，miRNA let-7a的模擬物轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞系后，caspase-3蛋白和BRAF蛋白表達(dá)均下降。
　　

6、結(jié)論：
　　 FFPE組織適合用來研究miRNA在黑素瘤中的表達(dá)，miRNA-let-7a在黑素瘤中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miRNA-let-7a可抑制黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，促進(jìn)凋亡的機(jī)制可能與miRNA-let-17a下調(diào)caspase-3有關(guān)。黑素瘤發(fā)病中的關(guān)鍵蛋白BRAF在黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中的表達(dá)明顯高于原代黑素細(xì)胞，miRNA-let-7a可下調(diào)BRAF蛋白的表達(dá)?？傊?，miRNA-let-7a可能在