桑枝活性成分分離純化及其藥理作用的研究.pdf

1、生物體的內(nèi)環(huán)境無時(shí)無刻不在生成自由基，自由基在生物體內(nèi)很容易與蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸反應(yīng)，引發(fā)氧化修飾作用，成為機(jī)體衰老及與衰老相關(guān)疾病的主要誘因。同時(shí)，隨著年齡的增長，機(jī)體的抗氧化防御能力卻在逐漸減弱，與衰老相關(guān)的疾病如腫瘤、心血管疾病、糖尿病、白內(nèi)障、老年性癡呆等發(fā)病機(jī)會(huì)大大增加，所以自由基與衰老相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)制之間的關(guān)系，成為了研究的新熱點(diǎn)。
　　 為了最大限度地降低自由基對(duì)機(jī)體的損害，人們開始尋求抗氧化劑，但人工合成的抗氧

2、化劑具有致癌性等很大的毒副作用。植物體富含黃酮類化合物等活性成分，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，是天然、安全的抗氧化劑來源物。為此，植物抗氧化劑的開發(fā)與應(yīng)用，成為了人們關(guān)注的研究領(lǐng)域。
　　 桑枝是桑科植物桑Morus alba L.的干燥嫩枝?！吨腥A人民共和國藥典》記載桑枝具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)、行水之功效，適用于風(fēng)寒濕痹、四肢拘攣、腳氣浮腫之病癥。臨床上主要用于治療肩臂關(guān)節(jié)及手足酸痛麻木、風(fēng)濕痹痛、癱瘓等多種疾病。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，桑

3、科桑屬植物具有降血糖、降血壓、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制花生四烯酸代謝等藥理活性，其藥理活性與其所含有活性成分密切相關(guān)。我國桑枝資源非常豐富，但對(duì)其利用主要局限于以桑枝藥材原料為主的初級(jí)開發(fā)，查明桑枝藥用活性成分和藥理作用，對(duì)發(fā)展天然中藥制劑等產(chǎn)品的深度開發(fā)，蘊(yùn)藏有巨大的發(fā)展空間。本課題以桑枝抗氧化性為中心，采用測定、分離、純化、鑒定等方法，對(duì)其中的活性物質(zhì)進(jìn)行分析，將所分離純化的活性物質(zhì)進(jìn)行一系列的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，探明其活性物質(zhì)

4、的藥理作用機(jī)理，從而為桑枝深度開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、對(duì)桑枝中黃酮類化合物提取和測定條件進(jìn)行優(yōu)化，確立了桑枝過160目，以80％乙醇作為溶劑，超聲波提取20 min,在80℃下回流30 min,重復(fù)提取3次，為桑枝黃酮類化合物提取的最佳實(shí)驗(yàn)方案。建立了桑枝黃酮類化合物含量測定的分光光度法，該方法精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率均符合測試要求。
　　 2、采用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)桑枝多糖的測定條件進(jìn)行優(yōu)化，確

5、立了桑枝過160目，超聲提取40 min,在100℃水浴中提取90 min,操重復(fù)2次，為最佳提取方案。對(duì)桑枝多糖進(jìn)行了精制，得到桑枝多糖與葡萄糖對(duì)照品的換算因子為4.96。桑枝中富含多糖，其含量在桑枝品種間存在顯著差異，高低相差約1.7倍；在同一品種的不同生長季節(jié)和老嫩程度間，春季新生嫩桑枝中多糖含量〉冬季一年生老桑枝中多糖含量〉春季老桑枝中多糖含量。
　　 3、DNJ本身沒有發(fā)色基團(tuán)，不能用液相色譜直接測定。本研究采用9-芴

6、基氯甲酸甲酯標(biāo)記、配有熒光檢測器的反相高效液相色譜法，建立了可檢測大數(shù)量桑枝樣品中DNJ含量的快速、可靠方法。利用正交實(shí)驗(yàn)法，確立了在30℃、pH7下反應(yīng)50 min為最佳衍生化條件。DNJ含量在桑品種間存在顯著差異，高低相差2.9倍，在同一品種的不同生長季節(jié)和老嫩程度間，冬季桑枝中含量最高，春季老枝中含量次之，春季新生嫩枝中含量最低，表明DNJ在桑枝中具有一定的累積作用。
　　 4、采用蛋白快速分離純化儀與示差檢測器相結(jié)合的方

7、法，分離純化桑枝中的多糖，用液相色譜測定其分子量，用離子色譜分析其單糖組成，用紅外光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。研究結(jié)果表明，桑枝多糖是α-構(gòu)形吡喃醛糖，分子量約為6.5×104,主要由鼠李糖、樹膠醛糖、半乳糖、葡萄糖和木糖組成，它們的摩爾比分別為9.1:24.1:44.1∶12.22∶7.8。
　　 5、對(duì)桑枝多糖進(jìn)行硫酸化、磷酸化、乙?；捅郊姿峄玫剿姆N衍生物，研究其結(jié)構(gòu)與抗氧化活性之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生化后的多糖的抗氧化活性顯

8、著提高，溫度和酸堿度顯著影響其抗氧化活性，抗氧化活性隨pH值升高而增高，隨著溫度升高而降低。
　　 6、根據(jù)DPPH的液相色譜特點(diǎn)，對(duì)桑枝乙醇提取液中的主要抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行了快速分離純化，確定了桑枝乙醇提取液中的主要抗氧化活性物質(zhì)為氧化芪三酚。此方法簡單、快速、方便，避免了傳統(tǒng)方法的反復(fù)操作和活性物質(zhì)的分解。
　　 7、采用在線液相色譜法和液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用法，鑒定桑枝中抗氧化活性成分，確立氧化芪三酚在品種間的分

9、布規(guī)律。桑枝富含有氧化芪三酚，其含量在桑品種間存在顯著差異，高低相差2.3倍。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于推動(dòng)桑枝及其制品的開發(fā)利用，具有一定的意義。
　　 8、對(duì)從桑枝中分離到的四種活性物質(zhì)——氧化芪三酚、二苯乙烯苷、桑色素和蕓香苷，進(jìn)行抗氧化活性檢驗(yàn)，確立它們的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，氧化芪三酚分子中的4和3＇位上的羥基，對(duì)于清除超氧離子、羥基自由基和DPPH具有重要作用；桑色素分子中3位上的羥基對(duì)于清除超氧離子和羥基自由基

10、有重要的作用，蕓香苷分子中的3位上的糖基對(duì)其還原力有重要的作用。
　　 9、用ICR小鼠的血清和肝臟中的生化指標(biāo)、組織病理學(xué)和細(xì)胞因子表達(dá)，研究桑枝乙醇提取液對(duì)四氧嘧啶引起的肝損傷的保護(hù)作用。研究結(jié)果表明，桑枝乙醇提取液具有護(hù)肝作用，其作用機(jī)理主要有以下三點(diǎn)：(1)桑枝提取液作為一種抗氧化劑，直接清除四氧嘧啶產(chǎn)生的自由基；(2)桑枝提取液作為一種金屬絡(luò)合劑，通過絡(luò)合金屬來抑制自由基的產(chǎn)生，從而降低自由基的損害；(3)桑枝提取液作

11、為糖苷酶的抑制劑，通過降低血糖濃度來抑制抗氧化活性酶的糖基化，從而提高其活性來降低損害。
　　 10、DPPH可以通過提高轉(zhuǎn)氨酶活性、MDA含量和NO水平，并伴隨GSH水平和SOD、CAT、GPx活性的降低，對(duì)機(jī)體肝臟產(chǎn)生損害，組織病理學(xué)觀察和炎癥因子表達(dá)的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了DPPH的此毒性。此研究結(jié)果對(duì)于建立DPPH的急性肝損傷模型，并以此模型來研究藥物對(duì)氧化壓力的相關(guān)疾病的治療作用，具有積極的意義。
　　 11、利

12、用硫代乙酰胺的肝損傷模型，研究桑枝中蕓香苷的護(hù)肝作用。結(jié)果表明，桑枝中蕓香苷具有明顯的護(hù)肝作用，其作用機(jī)理有以下四個(gè)方面：(1)通過促進(jìn)核糖體RNA的合成來促使肝細(xì)胞再生；(2)作為一種抗氧化劑來清除和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的含量；(3)通過穩(wěn)定細(xì)胞膜和調(diào)節(jié)通透性來阻止有毒物質(zhì)的進(jìn)入；(4)抑制星狀肝細(xì)胞向纖維原細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，從而來阻止肝硬化的發(fā)生。
　　 12、利用酒精引起的肝損傷模型，調(diào)查桑枝中氧化芪三酚及其糖苷的護(hù)肝作用。結(jié)果表

13、明，氧化芪三酚和二苯乙烯苷能夠通過提高抗氧化活性酶活性和GSH的含量、降低MDA水平、削弱TNF-α表達(dá)以及改善小鼠肝組織狀況等，對(duì)酒精引起的肝損傷起保護(hù)作用；氧化芪三酚的護(hù)肝作用顯著高于二苯乙烯苷的護(hù)肝作用，這兩種活性物質(zhì)的護(hù)肝作用與抗氧化活性密切相關(guān)。
　　 13、通過桑枝提取液組分中抗炎活性的篩選，從抗炎活性最強(qiáng)的組分中分離到氧化芪三酚和二苯乙烯苷兩種活性物質(zhì)。采用醋酸引起的扭體實(shí)驗(yàn)、福爾馬林引起的舔足實(shí)驗(yàn)、皮膚毛細(xì)管通透