心血管內(nèi)靶向定位基因遞送體系——載基因支架的實驗研究.pdf

1、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(PTCA)是冠狀動脈硬化性心臟病的主要治療手段，但PTCA術后血管再狹窄的發(fā)生率高達15-60％，迄今仍是臨床亟待解決的難題。轉基因技術的飛速發(fā)展為血管再狹窄的基因治療奠定了基礎。心血管內(nèi)基因治療的成功必須依靠有效的治療基因，安全的載體和可以把基因(和載體)遞送到血管內(nèi)靶部位的遞送體系。心血管內(nèi)基因治療的特殊性在于很難把基因專一性遞送到血管組織而不進入血液循環(huán)系統(tǒng)。以往的研究大多數(shù)采用球囊導管向血管內(nèi)灌注基因(和

2、載體)，研究表明，灌注到血管內(nèi)的載體大部分隨血流進入全身循環(huán)系統(tǒng)，到達病灶局部的基因很少，達不到治療效果。 血管內(nèi)支架攜帶基因有其獨特的優(yōu)勢，可以在植入支架的同時將基因遞送到心血管內(nèi)的病灶部位，借助支架與血管壁的緊密接觸，使基因被局部血管組織吸收，隨著基因的緩慢釋放，達到長期的基因轉染和表達?；蜉d體分為病毒載體和非病毒載體。病毒載體轉染效率高，但安全性方面存在潛在的危險性。非病毒載體安全性好，易于制備，近年來倍受關注。陽離子脂

3、質體和殼聚糖是目前研究最廣泛的非病毒載體，顯示出了一定的優(yōu)越性。 本課題針對心血管基因治療的主要技術難題，采用血管支架為基因遞送平臺，將抗DNA抗體—質粒DNA-陽離子脂質體三元復合納米基因載體和殼聚糖基因納米粒兩種非病毒載體結合在支架上，并通過體內(nèi)外試驗驗證這一新型血管內(nèi)基因遞送體系的有效性和可行性。 1.制備了新型抗DNA抗體—質粒DNA-陽離子脂質體三元復合納米基因載體(DAC)，篩選出了最佳配方，并初步進行了細胞

4、攝取及細胞基因轉染實驗。結果發(fā)現(xiàn)，抗DNA抗體—質粒DNA-陽離子脂質體可以自組裝為360nm左右的球形粒子，與傳統(tǒng)的質粒DNA-陽離子脂質體二元基因載體(DC組)相比，DAC體系對質粒DNA的包封率明顯增加，并且明顯地提高了細胞基因轉染效率。采用雙重熒光標記聯(lián)合共聚焦顯微觀察發(fā)現(xiàn)抗DNA抗體可促進質粒DNA進入細胞核。使用膠原對金屬支架表面進行涂層，通過化學和免疫雙重偶聯(lián)的方法將上述DAC載體固定化在支架表面。使用放射性同位素分別標記

5、抗DNA抗體和質粒DNA來測定支架結合量及釋放曲線。用細胞培養(yǎng)及動物體內(nèi)植入實驗驗證了這一新型基因遞送體系的轉基因效果。結果顯示，支架表面通過化學交聯(lián)的膠原涂層具有很好的均一性和結合穩(wěn)定性。在膠原表面通過化學偶聯(lián)方法結合抗DNA抗體的量明顯高于物理吸附組，并且可釋放緩慢達16天以上。通過免疫偶聯(lián)進一步結合質粒DNA的量是物理吸附組的兩倍，并緩慢釋放達13天以上。該新型基因支架遞送體系在細胞轉染實驗中顯示出高效和局部基因轉染的特征，兔頸動

6、脈植入實驗發(fā)現(xiàn)血管壁總細胞轉染率大約2.8％，其中新生內(nèi)膜轉染率最高，約7％；中膜次之，約為3％；血管外膜幾乎未有轉染。攜帶治療基因iNOS的支架植入豬冠狀動脈的實驗正在進行中。 2.制備了十二烷基化殼聚糖-pEGFP-C1基因納米粒并進行表征。將納米粒涂布于金屬支架表面，制備了攜帶十二烷基化殼聚糖基因納米粒的支架并進行電鏡觀察。將攜帶殼聚糖基因納米粒的支架進行細胞轉染和兔頸動脈體內(nèi)轉染實驗，結果顯示，十二烷基化殼聚糖-pEGF

7、P-C1納米粒為穩(wěn)定的球形，平均粒徑126nm，zeta電位+28±3mV。電鏡下，涂布于支架表面的納米粒呈不規(guī)則片狀分布于支架表面。細胞轉染實驗使用攜帶十二烷基化殼聚糖-pEGFP-C1基因納米粒的支架，顯示出局部轉染特征。動物實驗使用攜帶十二烷基化殼聚糖-pGL3質?；蚣{米粒(表達螢光素酶的質粒)的支架，回收支架上黏附的血管組織標本勻漿后，測定有高劑量螢光素酶表達，而對照組動脈及組織螢光素酶測定均為陰性，同實驗組支架植入處動脈螢光

8、素酶活性比較有顯著統(tǒng)計學差異，兩只動物肝臟標本發(fā)現(xiàn)微量螢光素酶表達。使用十二烷基化殼聚糖基因(偶聯(lián)pEGFP-C1質粒)支架，熒光顯微鏡及免疫組織化學檢查證明新生內(nèi)膜轉染率高達12.3％，中膜外膜未見陽性表達。 綜上所述，以支架為基礎的非病毒載體基因遞送體系是一種新型有效的血管內(nèi)基因遞送體系。通過化學與免疫雙重偶聯(lián)的方法，可有效的將質粒DNA結合在支架表面，在達到治療目的同時不出現(xiàn)基因的遠處播散，是一種有前途的基因遞送體系，可能