肥胖癥患者脂肪組織蛋白表達(dá)譜差異分析及cathepsin K功能初步研究.pdf

1、該研究的目的就是通過雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)來篩選肥胖癥患者和正常對(duì)照者脂肪組織蛋白表達(dá)譜的差異,并對(duì)某些差異表達(dá)的蛋白做初步的功能研究,希望能進(jìn)一步明確肥胖癥的病因,為其治療提供靶點(diǎn).首先,以大鼠脂肪組織為樣本摸索適合脂肪組織的樣品處理和雙向電泳條件.比較了不同成分的蛋白裂解液、三氯乙酸-丙酮沉淀法提純蛋白溶液、蛋白溶液的除鹽過程及不同PH范圍預(yù)制膠條對(duì)雙向電泳結(jié)果的影響.有了較成熟的雙向電泳分離技術(shù),我們將其應(yīng)用于肥胖和非肥胖個(gè)體

2、的脂肪組織,雙向電泳分離后硝酸銀染色得到的凝膠圖掃描后存為圖像文件用于PDquest軟件分析.PDquest軟件分析結(jié)果顯示兩組圖譜均有600個(gè)左右蛋白點(diǎn),大部分蛋白點(diǎn)的位置和灰度是一致的(r=0.68),灰度差異兩倍以上的點(diǎn)有130個(gè),經(jīng)student's T test分析兩組間有顯著性差異的點(diǎn)有約96個(gè),我們選擇有顯著性差異的十個(gè)點(diǎn)用于質(zhì)譜分析.MALDI-TOF-MS分析結(jié)果得到了七個(gè)蛋白點(diǎn)的肽指紋圖分別與cathepsin K(

3、組織蛋白酶K ctsk)、IGFBP-3、aminopeptidase、lipin、FGFR及兩種未知功能蛋白的酶解片段相匹配.最后培養(yǎng)了3T3-L1細(xì)胞株并誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞,通過半定量RT-PCR和Western-blot觀察在細(xì)胞分化不同階段ctsk mRNA及蛋白表達(dá)情況.發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分化過程ctsk及蛋白表達(dá)量逐漸增加,這說明cathepsin K可能是脂質(zhì)形成的一個(gè)標(biāo)志物.當(dāng)然,cathepsin K在脂肪形成及肥胖發(fā)生過

4、程中的具體作用尚需進(jìn)一步深入研究.該研究成功建立了適合脂肪組織雙向電泳的蛋白樣品準(zhǔn)備方法和電泳條件,并以這套程序結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)用于篩選肥胖患者和非肥胖對(duì)照者脂肪組織蛋白表達(dá)的差異,得到了幾種差異表達(dá)的蛋白質(zhì).對(duì)cathepsin K進(jìn)行了進(jìn)一步的研究,發(fā)現(xiàn)其mRNA及蛋白水平在肥胖個(gè)體和正常人間均有差異,而且它還與脂肪細(xì)胞分化有關(guān).當(dāng)然,這些差異表達(dá)的蛋白在肥胖發(fā)生及脂肪形成中的具體作用還需要體內(nèi)外的一系列實(shí)驗(yàn)來證實(shí),包括功能缺失及過