不同栽培品種橘的主要藥效成分動態(tài)變化與遺傳多樣性分析研究.pdf

1、中藥陳皮來源于蕓香科Rutaceae柑橘屬Citrus L.植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。橘的栽培品種較多，地域分布廣泛，我國長江以南各省均有栽培，作為陳皮來源品種的橘類植物主要為寬皮柑橘類，栽培品種有茶枝柑C.reticulata?Chachi‘、紅橘C. tangerina Hort. et Tanaka、樟頭紅C. reticulata Blanco cv.zhangshuens

2、is Hort、南豐蜜橘C. reticulata Blanco cv. Kinokuni、福橘C.reticulata?Tangerina‘等，主產于廣東、四川、重慶、江西、福建等地。
　　陳皮是中藥多栽培品種入藥的代表藥物，近年來由于柑橘品種不斷更新交替以及栽培更重視其食用價值，加之2010年版《中國藥典》對陳皮來源橘的栽培變種未作進一步規(guī)定，藥典收載的質量標準也無法客觀評價各栽培變種的品質差異，造成陳皮傳統(tǒng)來源品種大紅袍等面

3、臨淘汰，而一些藥用質量未經評價的柑橘品種以“雜陳皮”流通于市場，導致陳皮藥材質量問題突出，臨床療效難以保證。因此，亟需對市場上流通的陳皮入藥品種的遺傳差異、化學成分、藥理作用等進行系統(tǒng)評價研究，為進一步規(guī)范陳皮入藥品種，確保陳皮藥材質量穩(wěn)定可控和臨床用藥安全有效提供科學依據。本文首次對川陳皮傳統(tǒng)來源品種大紅袍 C. reticulata?Dahongpao‘(紅橘品系)、贛陳皮來源品種南豐蜜橘和樟頭紅中主要藥效成分—黃酮、總酚酸、生物堿

4、、多糖含量在不同采收期內的動態(tài)變化進行研究，明確不同藥效成分的動態(tài)變化規(guī)律，為選擇陳皮入藥品種的次生代謝產物的等同性研究奠定基礎；并對大紅袍果實發(fā)育期(7～12月份)內葉片和果皮中黃酮類成分的合成積累與3種次生代謝關鍵酶(PAL、C4H、4CL)活性的關系進行系統(tǒng)研究，首次初步闡釋了大紅袍果實發(fā)育過程中黃酮類成分生物合成代謝機制，揭示了陳皮成分積累與陳皮入藥成熟度的科學內涵，為進一步規(guī)范陳皮傳統(tǒng)入藥品種的采收加工提供依據；對陳皮傳統(tǒng)入藥

5、品種茶枝柑、大紅袍、南豐蜜橘及其市場上混雜入藥的柑橘品種天草 C. reticulata hybrid等22個柑橘品種的遺傳多樣性及DNA條形碼進行研究，以期為陳皮種質資源的開發(fā)和合理利用提供參考，也為陳皮入藥品種的進一步篩選提供遺傳學依據。具體研究內容及結果如下：
　　1不同栽培品種陳皮藥材主要藥效成分動態(tài)變化研究
　　本研究采用HPLC法測定不同采收期大紅袍、樟頭紅、南豐蜜橘中4種主要黃酮類成分蕓香柚皮苷、橙皮苷、川陳皮

6、素、橘皮素和生物堿類成分辛弗林的含量，UV分光光度法測定總黃酮、總酚酸和多糖的含量。結果表明：3個栽培品種中黃酮類成分蕓香柚皮苷、川陳皮素、橘皮素和辛弗林均隨采收時間的推遲而逐漸降低至果實成熟時趨于穩(wěn)定。橙皮苷、總黃酮和總酚酸、多糖在整個采收期內呈現起伏波動的變化趨勢，橙皮苷、總黃酮和總酚酸在整個采收期內的總體變化呈下降趨勢，橙皮苷和總黃酮在幼果期至果實成熟前含量均呈降低趨勢，在果實成熟后含量有所回升；總酚酸在果實膨大期至著色期含量變化

7、幅度較大，先迅速升高，后持續(xù)降至果實成熟時趨于穩(wěn)定；多糖在果實著色期前均持續(xù)升高至著色期后急劇下降，于成熟期含量大幅上升至最高水平。從各藥效成分在整個采收期內的積累量來看，3個品種中黃酮類成分蕓香柚皮苷的含量存在明顯差異，其積累量的相對高低為樟頭紅＞南豐蜜橘＞大紅袍；橙皮苷、總黃酮及其生物堿類成分辛弗林的含量也存在明顯差異，其含量高低為南豐蜜橘＞大紅袍＞樟頭紅，而其它類成分的積累量差異不明顯，原因可能與調控黃酮類成分合成積累的次生代謝關

8、鍵酶的活性表達有關，具體的調控機制還有待繼續(xù)深入研究。該研究初步明確了3個栽培品種陳皮中主要藥效成分的動態(tài)變化規(guī)律，為進一步選擇陳皮入藥品種的次生代謝產物的等同性研究奠定基礎。
　　2大紅袍葉片、果皮中黃酮類成分積累的初步研究
　　對大紅袍、南豐蜜橘、樟頭紅中主要藥效成分的動態(tài)變化研究表明，3個栽培品種中黃酮類成分橙皮苷和總黃酮的含量隨果實發(fā)育期的推遲存在明顯差異。本研究首次以川陳皮來源品種大紅袍葉片和果皮為對象，對其果實發(fā)

9、育的幼果期至成熟期內(7～12月份)葉片中黃酮類成分積累與其次生合成代謝關鍵酶 PAL、C4H、4CL活性的相關性及其同期果皮中黃酮類成分積累的內在關聯(lián)性進行系統(tǒng)研究，共比較了40批大紅袍葉片和果皮樣品。
　　2.1大紅袍葉片中黃酮類成分積累與其次生代謝3種關鍵酶的相關性研究
　　本研究在前期課題組研究基礎上建立了UPLC測定大紅袍葉片中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量方法，對不同采收期內大紅袍葉片中3種主要黃酮類成分的含量進

10、行測定，并運用UV分光光度法追蹤測定了葉片中黃酮類成分合成代謝的3種關鍵酶PAL、C4H、4CL活性和總黃酮的含量，分析黃酮類成分積累與3種關鍵酶活性的關系。結果表明：大紅袍葉片中橙皮苷和總黃酮的積累與 PAL、C4H活性從果實發(fā)育的幼果期到膨大期內呈現相似的變化趨勢，橙皮苷和總黃酮的含量逐漸增加，PAL、C4H酶的活性也逐漸升高，從果實著色期至成熟期出現了分化，橙皮苷和總黃酮含量持續(xù)升高，而 PAL、C4H活性持續(xù)降低，而在整個采收期

11、內二者含量與4CL酶活性之間沒有明顯的關系；4CL酶活性的變化與川陳皮素和橘皮素含量之間也呈現相似的變化，從果實膨大期至著色前期呈現先降低后升高的同步變化趨勢，之后從果實著色期至成熟期出現分化，川陳皮素和橘皮素含量升高，4CL酶活性降低，而在整個采收期內二者含量與PAL、C4H酶活性的關系不明顯。大紅袍葉片中黃酮類成分積累與3種次生代謝合成關鍵酶出現分化的具體原因可能與其栽培環(huán)境的變化及調控黃酮類成分合成的其他關鍵酶活性的調控有關，其中

12、復雜的合成代謝調控機制還有待進一步深入研究。該研究初步揭示了大紅袍葉片中黃酮類成分生物合成積累與PAL、C4H、4CL關鍵酶活性的關系，為研究大紅袍葉片中黃酮類成分的合成代謝機制奠定基礎。
　　2.2大紅袍葉片與果皮中黃酮類成分積累的內在關聯(lián)性研究
　　為進一步深入研究大紅袍果皮中黃酮類成分合成積累的代謝機制，本研究在對大紅袍葉片中黃酮類成分合成積累研究的基礎上，對同期采集的大紅袍果皮中黃酮類成分的積累進行系統(tǒng)研究，利用HP

13、LC法測定了與葉片同期采收的大紅袍果皮中3種主要黃酮類成分橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量，并運用UV分光光度法測定其葉片中總黃酮的含量，分析大紅袍果實發(fā)育期內大紅袍果皮和葉片中黃酮類成分積累的內在關聯(lián)性。結果表明：在大紅袍果實發(fā)育的幼果期到成熟期內葉片和果皮中黃酮類成分的變化趨勢不盡相同，在果實發(fā)育的膨大期到成熟期內二者黃酮類成分的積累變化較為明顯，呈現出增減互補的變化趨勢，葉片中橙皮苷和總黃酮的含量隨成熟度的增加逐漸升高，而果皮中橙皮

14、苷和總黃酮的含量逐漸降低，葉片中橘皮素和川陳皮素含量隨成熟度的增加緩慢升高，而果皮中則逐漸降低。該研究初步表明了大紅袍葉片和果皮中黃酮類成分積累的內在關聯(lián)性，為闡釋大紅袍中黃酮類成分積累與陳皮入藥成熟度的相關性研究奠定基礎。
　　3不同栽培品種柑橘的遺傳多樣性分析研究
　　本研究對市場上流通的陳皮入藥品種進行遺傳多樣性分析研究，為進一步篩選陳皮入藥的柑橘品種提供遺傳學依據。采用AFLP分子標記技術對茶枝柑、福橘、大紅袍、南豐

15、蜜橘、樟頭紅、天草等22個柑橘品種進行遺傳多樣性研究。結果表明：從12對EcoRⅠ/MseⅠ引物組合中篩選出6對引物，對樣本進行PCR批量擴增，經高效毛細管電泳檢測得到的樣本DNA多態(tài)性條帶總數為472條，多態(tài)性比例達到80％以上，平均每對引物擴增出78條DNA多態(tài)性條帶，能夠較好地反映柑橘樣本間的遺傳信息。且基于遺傳相似性系數構建的 UPGMA聚類圖能夠將不同栽培品種的茶枝柑、大紅袍、福橘、椪柑、臍橙、不知火、天草等各聚為一類，其中同

16、一品種不同產地的茶枝柑、大紅袍、椪柑、臍橙、天草等各聚為一類，表明品種間的遺傳差異受地域的影響較小；化學成分相似的南豐蜜橘和樟頭紅也單獨聚為一類，與正品茶枝柑比較椪柑與其親緣關系最近，而毛氣柑與其親緣關系最遠。以上研究結果顯示AFLP分子標記能夠較好地界定劃分不同栽培品種的柑橘，從DNA水平上表征了柑橘各栽培品種的遺傳多樣性，建議在進行陳皮入藥品種篩選時可以從與陳皮道地品種親緣關系較近的柑橘品種入手。
　　4不同栽培品種柑橘的DN

17、A條形碼初步研究
　　本研究以陳皮主要栽培品種茶枝柑、大紅袍、南豐蜜橘等13個柑橘品種為研究對象，以ITS2序列為基礎對其進行DNA條形碼分子鑒定分析研究。結果表明：基于K2P距離構建的NJ發(fā)育樹不能較好地區(qū)分鑒定各陳皮栽培品種，研究結果與文獻報道一致。原因在于陳皮來源植物寬皮柑橘的栽培品種之間普遍存在自然雜交和芽變現象，特別是經雜交育種的雜柑(天草、不知火等)，其DNA片段上僅存在少數位點的單核苷酸變異，其ITS2序列存在高度相