miR-34a通過調(diào)控N-myc表達抑制MDSCs凋亡的研究.pdf

1、microRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20～25個核苷酸。近年來研究表明miRNAs在生物學的各個過程中發(fā)揮了極其重要的作用:如細胞和個體發(fā)育、器官形成、造血生成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝、細菌與病毒的感染和機體防御、炎癥的發(fā)生發(fā)展等。同樣，microRNAs在免疫系統(tǒng)中亦有很好的研究。已有的研究表明microRNAs在T細胞、B細胞、DC、NK細胞分化發(fā)育中均發(fā)揮重要作

2、用，從而參與了機體先天免疫和獲得性免疫應答。Rafael Casellas實驗室的研究結(jié)果表明miR-34a在各種免疫細胞中呈現(xiàn)出不同的表達水平，由此我們推測miR-34a可能在淋巴細胞的分化發(fā)育中發(fā)揮重要作用。為進一步探討miR-34a在淋巴細胞分化發(fā)育中的作用，在本課題中，我們主要通過建立miR-34a嵌合小鼠模型和miR-34a轉(zhuǎn)基因小鼠模型并應用這兩種動物模型來探討miR-34a在淋巴細胞分化發(fā)育中的作用。首先，我們構(gòu)建了miR

3、-34a過表達質(zhì)粒pMDH1-PGK-GFP-miR-34a，并通過qPCR、流式分析等驗證了miR-34a過表達質(zhì)粒pMDH1-PGK-GFP-miR-34a的成功表達，在此基礎(chǔ)上，我們一方面制備了miR-34a的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染小鼠的骨髓干細胞，建立了miR-34a的嵌合小鼠模型，通過PCR及FACS驗證了小鼠模型的成功構(gòu)建;另一方面，我們將pMDH1-PGK-GFP-miR-34a用HindⅢ酶切線性化，經(jīng)顯微注射到受精卵細胞中制

4、備了miR-34a轉(zhuǎn)基因小鼠模型。經(jīng)FACS分析發(fā)現(xiàn):無論在嵌合小鼠中，還是在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，過表達了miR-34a后，無論是在骨髓還是在脾臟中，B細胞的數(shù)目均有顯著減少，此結(jié)果與Baltimore實驗室研究結(jié)果一致，進一步說明了嵌合小鼠模型和轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建成功。進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-34a后，無論是在嵌合模型還是在轉(zhuǎn)基因模型中，髓系來源的抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells，MD

5、SCs)都顯著高于其在正常小鼠體內(nèi)的比例，且在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)MDSCs的絕對數(shù)升高。通過BrdU染色研究發(fā)現(xiàn)BM和脾臟中BrdU陽性細胞比例未見顯著差異，這一結(jié)果提示miR-34a并不影響MDSCs細胞的自我更新或增殖。進一步分析MDPs等早期分化祖細胞發(fā)現(xiàn):和WT小鼠比較，MDPs，GMPs等祖細胞比例未發(fā)現(xiàn)有顯著差異，但用AnnexinⅤ染色，經(jīng)FACS檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠的MDSCs的凋亡明顯減少，這提示著miR-34a很可

6、能是通過減少MDSCs的凋亡而使其百分比和絕對數(shù)增高。為進一步分析miR-34a抑制MDSCs凋亡的作用機制，尋找miR-34a在MDSCs中的靶基因，我們應用miRWalk軟件預測、熒光素酶報告系統(tǒng)檢測以及實時定量PCR及Western-blot等研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能通過作用于N-myc等來調(diào)控MDSCs的發(fā)育。
　　為進一步探討miR-34a是否影響MDSCs的功能，我們應用流式細胞儀分選MDSCs，并應用實時定量PC

7、R檢測發(fā)現(xiàn):和WT MDSCs相比，脾臟中miR-34a過表達的MDSCs產(chǎn)生高水平的TNF、iNOS、IL-17，而Arg、TGF-β的表達較低。但在BM MDSCs中miR-34a過表達后TNF、iNOS、IL-6、IL-10、IL-12等表達較高。為驗證這種細胞因子表達譜的變化是否影響MDSCs的功能，我們分別在miR-34a和WT小鼠中建立LLC小鼠模型，發(fā)現(xiàn)兩組腫瘤生長并無顯著差異?？紤]到miR-34a同樣在其他細胞中過表達，

8、為排除其他細胞的影響，我們從miR-34a轉(zhuǎn)基因模型中純化BM MDSCs并在腫瘤注射前通過眼靜脈方式注射到小鼠體內(nèi)，和WT MDSCs輸注組相比，miR-34a MDSCs并未顯著影響LLC腫瘤在體內(nèi)的生長。這些結(jié)果提示盡管miR-34a改變了MDSCs細胞因子的表達譜，但并未影響MDSCs對腫瘤生長的影響。
　　總結(jié)我們現(xiàn)有研究，我們成功建立了miR-34a過表達嵌合小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠動物模型，通過研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a通過抑