乏氧誘導(dǎo)因子α調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文乏氧誘導(dǎo)因子α調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究姓名：陳新霞申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：護(hù)理學(xué)指導(dǎo)教師：婁鳳蘭;徐大為20070520山東大學(xué)碩士學(xué)位論文乏氧誘導(dǎo)因子Q 調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞端粒酶表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究碩士研究生陳新霞指導(dǎo)教師 婁鳳蘭教授徐大為教授研究目的：端粒酶及其逆轉(zhuǎn)錄酶組分h T E R T 是細(xì)胞永生化和惡性轉(zhuǎn)化的必需成分。以往研究提示乏氧誘導(dǎo)因子1 a ( 肼．1 a ) 可能參與h T E R T 基因

2、表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和端粒酶活性調(diào)控，但結(jié)果并不一致。H I F - 2 a 在h T E R T 表達(dá)調(diào)控中的作用尚未見報道。作為惡性腫瘤細(xì)胞乏氧誘導(dǎo)的關(guān)鍵成分，H I F s 通過其下游基因調(diào)控細(xì)胞的各種功能，參與血管生成、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等過程，一般被看作腫瘤促進(jìn)因子，然而，最近的研究提示，H I F $ 在腫瘤形成中的作用可能遠(yuǎn)較此復(fù)雜，其對腫瘤的影響可能與細(xì)胞類型及特定的外部環(huán)境有關(guān)。本研究的目的是探討不同類型的人類腫瘤中，H I F

3、 ．1 a 和H I F ．2 a 對細(xì)胞永生化和惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵成分- - h T E R T 表達(dá)的影響及機(jī)制。研究方法l 3 7 0 C 、5 ％C 0 2 ／9 5 ％空氣條件下，腎細(xì)胞癌細(xì)胞( R C C ) 株A 4 9 9 、T K l 0 和C a k i ．2 ，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U 2 5 1 、U 3 7 3 和U 5 6 3 在含1 0 ％胎牛血清、2 Ⅱl ML 谷氨酰胺和抗生素( 1 0 0 U ／m l 青霉素

4、和鏈霉素) 的R P M l l 6 4 0 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至對數(shù)生長期后進(jìn)行如下處理：1 ) 六株細(xì)胞均進(jìn)行乏氧處理，方法為：將細(xì)胞培養(yǎng)于l ％0 2 條件下，或使用1 5 0 p M 去鐵敏處理8 ～1 0 小時。然后收獲細(xì)胞，R T - P C R分析h T E R T m R N A 表達(dá)情況，使用端粒酶P C R E L I S A 試劑盒檢測端粒酶活性。2 ) 使用特異性針對H I F - 2 a m R N A 的s i

5、R N A 抑制A 4 9 8 細(xì)胞中H I F - 2 a 的表達(dá)，處理4 8 小時后測定其h T E R T m R N A 水平。3 ) 用表達(dá)H I F ．2 a 的質(zhì)粒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染U 2 5 1 和U 3 7 3 細(xì)胞，6 4 1 8 選擇后收獲，分析其中h T E R Tm R N A 的表達(dá)，同時采用W e s t e r n N o t 方法檢測轉(zhuǎn)染了H I F - 2 a 表達(dá)載體的細(xì)胞中H I F - 2 a 蛋白的

6、表達(dá)情況。4 ) 將含有h T E R T 核心啟動子插入序列及乏氧反應(yīng)元件H R E 的p 1 8 1 與表達(dá)H I F 一1a 或H I F - 2 a 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞株M 9 8 和C a M 一2 、膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U 2 5 1和U 3 7 3 ，用雙熒光素酶報告測試系統(tǒng)測定上述四株細(xì)胞中h T E R T 基因啟動子的活性變化。5 ) 使用針對H I F - 2 a 、p 3 0 0 和乙?；M蛋白H 3 的特異抗體，與甲