牛傳染性鼻氣管炎病毒gB蛋白的分段表達與間接ELISA診斷方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、牛傳染性鼻氣管炎(Infectiousbovinerhinotracheitis，IBR)，是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus，IBRV)引起的牛的一種急性、熱性、接觸性傳染病。病毒基因組編碼11種糖蛋白，其中g(shù)B蛋白是病毒的囊膜表面展示的主要蛋白之一，也是主要的免疫原蛋白。本試驗根據(jù)GenBank公布的IBRV基因序列，以IBRVBarthaNu/67株DNA為模板，分兩

2、段PCR擴增gB基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，分別可見約1776bp(命名為gBⅠ)和1551bp(命名為gBⅡ)的特異帶，將目的基因克隆到pGEM-T載體，XhoⅠ和NsiⅠ雙酶切，回收帶粘末端的T-gBⅠ和gBⅡ，連接轉(zhuǎn)化，得到gB基因的完整克隆T-gB。 用生物學(xué)軟件DNAstar分析gB蛋白氨基酸序列，對抗原性高、水溶性強和表面展示概率高的3個區(qū)域(分別命名為gBB，Ala192-Leu268；gBC，Met308-L

3、eu402；gBD，Ala494-Leu598)進行了原核表達。設(shè)計三對引物以構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板擴增3個目的區(qū)域，如前所述方法得到T-gBB、T-gBC和T-gBD，BamHⅠ和HindⅢ分別雙酶切，回收目的片段，定向克隆到同樣處理的pET32a表達載體。PCR鑒定并測序確定序列正確后，三個重組表達質(zhì)粒分別命名為rpET32a-gBB，rpET32a-gBC，rpET32a-gBD。將三個陽性重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入表達宿主菌BL21(DE3

4、)中，經(jīng)終濃度為0.6mmol/LIPTG誘導(dǎo)，成功表達了目的蛋白，分別命名為r32a-gBB，r32a-gBC，r32a-gBD。三個重組蛋白均以部分可溶形式表達，重組蛋白大小與預(yù)期相符，分別為29.2KD，31.2KD和32.4KD，表達效率分別為40.9％，41.2％和61.4％。表達蛋白在非變性條件下純化后，重組蛋白的濃度分別為2.000mg/mL，2.400mg/mL和2.000mg/mL，純度分別為79.2％、88.2％和7

5、6.4％。經(jīng)ELISA檢測表明，三個純化的重組蛋白均與牛傳染性鼻氣管炎陽性血清樣品發(fā)生反應(yīng)，與牛傳染性鼻氣管炎陰性血清無任何反應(yīng)，純化的載體蛋白部分對陰陽性血清沒有反應(yīng)。r32a-gBB對牛流熱(BEV)、牛肺疫(CBPP)、牛病毒性腹瀉(BVD)、牛結(jié)核(BTB)、牛副結(jié)核(PBB)以及牛赤羽病(BAD)六種其它牛病種抗體陽性血清沒有交叉反應(yīng)，顯示表達蛋白具有良好的抗原性和特異性。 把表達的r32a-gBB重組蛋白經(jīng)初步純化后

6、用作包被抗原，建立了檢測IBRV血清抗體的間接ELISA方法，并確定了最適抗原包被濃度(50μg/mL)、最適血清稀釋度(1：40)、血清最適作用時間(90min)、最適封閉液(3％明膠)、最適封閉時間(90min)、酶標(biāo)抗體最適稀釋度(1：5000)、酶標(biāo)二抗最適作用時間(120min)、底物最適顯色時間(9min)和判定界值(0.395)。包被的重組抗原不與上述六中牛疫病陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，表明建立的ELISA診斷方法具有良好的特

7、異性。批內(nèi)重復(fù)試驗和批間重復(fù)試驗變異系數(shù)均小于10％，說明該方法具有很好的重復(fù)性。該診斷方法與中和試驗相比較，特異性、敏感性和符合率分別為83.3％、90.9％和88.9％；與進口法國IBRV全病毒ELISA抗體診斷試劑盒比較，特異性、敏感性和符合率分別為92％、92.7％和92.5％。應(yīng)用該診斷方法檢測保存的我國部分地區(qū)牛血清樣品，陽性率為71.81％。上述結(jié)果表明該診斷方法具有良好的特異性和敏感性，顯示了良好的應(yīng)用前景。 本