靈芝孢子粉對(duì)荷H22肝癌小鼠樹突狀細(xì)胞的影響及其抗腫瘤效應(yīng)研究.pdf

1、研究背景 近年來中藥的抗腫瘤作用日益受到人們的廣泛關(guān)注。靈芝孢子粉是一種富含高分子多糖、三萜類化合物、腺苷、多肽、生物堿及微量元素的中藥，已有研究表明靈芝孢子粉能夠防止腫瘤的發(fā)生和抑制腫瘤生長(zhǎng)，其抗腫瘤作用不是直接對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，而是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答進(jìn)而提高機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)。 體內(nèi)存在多種免疫監(jiān)視機(jī)制發(fā)揮著抗腫瘤作用，而免疫活性細(xì)胞致敏、激活和擴(kuò)增又依賴于抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcel

2、l，Aec)提呈相應(yīng)的抗原多肽及共刺激信號(hào)。樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)是目前已知功能最強(qiáng)大的APC，其膜表面高表達(dá)MHC分子及多種共刺激分子和黏附分子，能夠有效攝取和處理抗原，然后遷移至T細(xì)胞區(qū)，激活未致敏T細(xì)胞，顯著刺激其增殖。DC在機(jī)體的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，通過捕獲、加工、提呈等一系列過程，可以把腫瘤抗原以MHC-抗原肽復(fù)合物的形式，表達(dá)于細(xì)胞表面供初始T細(xì)胞識(shí)別，使之激活并增殖分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(

3、CTL)，進(jìn)一步識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，從而啟動(dòng)機(jī)體自身特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。有研究表明腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的DC即腫瘤浸潤(rùn)性樹突狀細(xì)胞(tumorinfiltratingdendriticcell，TIDC)與患者的預(yù)后成正相關(guān)，瘤組織中DC浸潤(rùn)多者，預(yù)后良好。因此，DC作為機(jī)體初次免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，其生物功能狀態(tài)直接影響著機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，并起關(guān)鍵作用。 DC的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展為中醫(yī)藥抗腫瘤免疫藥理研究提供了新的視角，即中醫(yī)

4、藥抗腫瘤的免疫藥理學(xué)機(jī)制是否部分與影響腫瘤機(jī)體DC細(xì)胞增殖、成熟、表型及功能的改變有關(guān)。已有研究表明靈芝孢子粉具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)，關(guān)于靈芝孢子粉免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制還不十分清楚，普遍認(rèn)為其能夠激活T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)等免疫活性細(xì)胞，提高其殺傷效能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖分化，發(fā)揮抗腫瘤作用。但其與DC的關(guān)系未見報(bào)道。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本研究目的是觀察不同濃度靈芝孢子粉對(duì)荷H22肝癌小

5、鼠髓源性、脾源性DC分化發(fā)育、表面標(biāo)志、抗原提呈功能的影響；通過S．100蛋白染色觀察腫瘤組織DC的浸潤(rùn)情況；并且探討靈芝孢子粉的抗腫瘤效應(yīng)，從而揭示靈芝孢子粉與DC相關(guān)的抗腫瘤機(jī)制，以便為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1．制備荷H22肝癌小鼠。 2．接種同時(shí)應(yīng)用不同濃度靈芝孢子粉(1g／kg．d，2gJkg．d，3g/kg．d)連續(xù)14d灌胃荷H22肝癌小鼠，設(shè)生理鹽水對(duì)照組，末次給藥24h后拉頸處死小鼠，

6、無菌獲取骨髓細(xì)胞及脾細(xì)胞，應(yīng)用rmGM,CSF和rmIL-4體外誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞和脾細(xì)胞生成DC，同時(shí)培養(yǎng)液中繼續(xù)加入不同濃度靈芝孢子粉(0．8μ．g／mL、3．2μg／mL、12.8μg／mL)，使其與DC共培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組，通過雙目倒置顯微鏡觀察DC的形態(tài)變化。 3．培養(yǎng)8d后收集各組成熟的DC，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志CDlla與CD86的表達(dá)情況。 4．應(yīng)用MTT法檢測(cè)DC激活的T細(xì)胞對(duì)H22肝

7、癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。 5．通過免疫組化S-100蛋白染色的方法觀察腫瘤組織及其周圍DC的浸潤(rùn)情況。 6．通過脾指數(shù)，胸腺指數(shù)觀察靈芝孢子粉對(duì)免疫功能的影響。 7．通過腫瘤抑制率的測(cè)定來觀察其抗腫瘤效應(yīng)。 8．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包SPSS13．0，結(jié)果用-x±s表示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用f檢驗(yàn)，各實(shí)驗(yàn)組之間的比較采用單因素方差(ANOVA)分析，顯著性水準(zhǔn)為P

8、．靈芝孢子粉能夠促進(jìn)荷H22肝癌小鼠髓源性DC的分化成熟，培養(yǎng)4d后可見中、高劑量組大部分細(xì)胞有突起伸出，并有大量突起交織在一起，為典型的DC形態(tài)，培養(yǎng)7d時(shí)，中、高劑量組(3．2ug／mE、12．8μg／mL)大量樹突狀形態(tài)細(xì)胞從貼壁、半懸浮狀態(tài)變?yōu)閼腋顟B(tài)；低、中、高劑量(0．8、3．2μg／mL、12．8ug／mL)組CDlla的表達(dá)分別為38．12±2．78、46．61±5．31、54．03±5．68(％)，CD86的表達(dá)分別為

9、53．02+4．80、61．73±5．66、70．61±3．73(％)，與對(duì)照組相比P

10、，高劑量組作用顯著，與對(duì)照組相比P