中國漢族人RhD陰性表型的分子機理研究.pdf

1、Rh血型系統(tǒng)是人類血型中最具多態(tài)性和免疫遺傳特性的一個系統(tǒng)，迄今已發(fā)現含有49個獨立的抗原，是輸血醫(yī)學中除ABO血型之外最具臨床意義的一個血型系統(tǒng)。RhD抗原的高免疫原性常常會引起胎兒和新生兒溶血病(HDFN)、溶血性輸血反應和自身免疫性溶血性貧血等疾病。自上世紀90年代編碼2個Rh蛋白的基因RHD和RHCE被克隆以來，人們對Rh血型系統(tǒng)的分子機理已獲得相當多的認識。近年來對RhD抗原和RHD基因的免疫學及分子生物學研究已成為國際上的熱

2、點并取得重要進展。2000年，研究人員發(fā)現RHD基因兩側各有一段Rh盒子(R}lestJs boxes)基因，其序列的高度同源性引發(fā)了RHD基因的缺失并形成融合基因，這是人類第一次構思和闡明RhD陰性表型形成的分子機制。對RhD抗原和眾多D變種(迄今已發(fā)現40種弱D型和25種部分D型)的研究表朗RhD的血清學表型存在復雜的分子機制，包括單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、基因缺失和插入、基因互換和重組、基因轉換等。在Rh血型分子機制逐漸闡明之后

3、，以PCR為基礎的分子生物學分析已應用于臨床，其中RHD基因定型和在孕婦血漿中檢測胎兒RHD基因等技術最具臨床價值。另外，分析孕婦丈夫RHD基因的純合性可預測胎兒患HDFN的幾率，應用基因定型可解決獻血者的疑難血型鑒定、反復大量輸血或近期輸血病人的血型鑒定、D變種(弱D、部分D型)的鑒定等血型血清學中的疑難問題。 然而對RHD基因的研究顯示其存在明顯的種族差異，以高加索人基因結構為基礎的基因定型等臨床應用在其他民族中存在局限性。

4、在非洲人RhD陰性個體中普遍存在RHDΨ基因和RHD-CE-D<'s>基因，從而造成RHD基因定型的假陽性。亞洲人中存在一種稱為Del型的弱D型個體，該型在日本人或中國人RhD陰性個體中所占比例為10-33﹪。Del型個體存在幾乎完整的RHD基因，其弱D抗原只能通過繁瑣耗時的吸收放散實驗才可檢測出來。另外在亞洲人RhD陰性個體中還存在一定比例的RHD-CE-D雜化基因及少量基因突變。對亞洲人(包括中國人)RHD基因的研究遠滯后于對高加索

5、人的研究，關于Del型的分子機制和免疫機制、D-CE-D雜化基因、弱D型和部分D型、Rh盒子基因序列等分子機理仍未清楚，因而無法準確可靠地將基因定型技術應用于臨床。本研究在以往研究的基礎上，運用實時熒光定量PCR、多重PCR、PCR-RFLP、DNA序列分析等先進技術對中國漢族人RhD陰性RHD基因結構進行系統(tǒng)性的分子生物學分析和研究，以建立中國人RHD基因結構的數據庫并將以此為基礎將分子生物學技術應用于新生兒溶血病產前診斷、疑難血型的

6、基因定型等臨床醫(yī)學中。 [目的]： 研究和分析中國漢族人RhD陰性表型個體、RhD陽性表型個體和部分D表型的RHD及Rh盒子基因的結構，以闡明中國漢族人群RhD陰性表型形成的分子機理，并對Rh盒子基因的擴增產物進行分析以確定RHD基因的純合性，建立中國人RHD基因結構的數據庫并以此為基礎將基因定型技術應用于臨床醫(yī)學中。 [方法]： 1．首先對大量獻血者樣本采用標準血清學方法進行RhD抗原鑒定。對所有RhD

7、抗原初篩陰性樣本，采用間接抗人球蛋白方法和吸收放散試驗進一步檢測D抗原，以排除或確認弱D型、De1型或部分D表型.對RhD陰性樣本進行RhCcEe表型的血清學和分子生物學分型。 2．選擇176例RhD陰性標本、11例RhD陽性標本和8例部分D標本，采用3種進口DNA提取試劑盒，提取其基因組DNA。所選擇樣本均系中國漢族人，無親緣關系。 3．對65例RhD陰性標本和11例RhD陽性標本，采用實時熒光定量PCR(Realti

8、me quantitative PCR，RQ-PCR)技術檢測其RHD因第7外顯子。 4．采用多重PCR(Multiplex PCR-sequence specific primer，MPX-PCR)技術檢測所有176例樣本RHD因第3，4，5，6，7和9外顯子，擴增產物以12﹪的聚丙烯酰胺凝膠檢測。 5．根據RHD基因的內含子序列設計RHD基因的特異性測序引物，對部分樣本進行RHD基因外顯子特異性PCR-SSP分析。對

9、RHD基因第6和10外顯子，采用高保真(Exparld high fidelity)PCR擴增體系。 6．采用高保真PCR擴增體系，擴增部分樣本的Rh盒子基因的特異性序列并進行測序分析。 7．對所有176例樣本采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性(Restrictfragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術進行RHD基因的純合性測定。 8．采用根據RHD基因的內含子序列設計的

10、RHD基因特異性測序引物，對部分樣本的RHD基因10個外顯子進行擴增，擴增產物進行測序分析。 [結果]： 1．對176例RhD陰性樣本的分析表明，114例(65﹪)樣本在多重PCR-SSP分析中顯示缺失RHD基因，在PCR-RFLP分析中顯示為純合的RHD基因陰性。 2．49例(28﹪)樣本在血清學吸收放散試驗中顯示為Del表型。其MPX-PCR分析顯示均存在RHD基因6個外顯子，PCR-RFLP分析顯示其中43

11、例為雜合的RHD基因，6例為純合的RHD基因。對該組中22例樣本的測序分析顯示均存在一個RHD因第9外顯子第1227位G>A的突變，該突變是Del表型所特有的。 3．12例(6﹪)樣本MPX-PCR顯示缺失RHD基因，但PCR-RFLP分析顯示存在1個RHD基因，進一步的測序PCR分析表明它們至少存在RHD基因第1和10外顯子。 4．1例(1﹪)樣本MPX-PCR分析顯示存在RHD基因，但缺失第6外顯子。對其RHD因全部

12、10個外顯子的測序分析表明，該樣本存在一個新的933位C>A的突變。 5．對27例在多重PCR分析中顯示缺失RHD基因和在RFLP分析中為RHD基因陰性純合樣本的雜化Rh盒子基因進行DNA測序分析，表明中國漢族人存在與高加索人相一致的雜化Rh盒子基因序列。 6．對8例部分D表型樣本的分子生物學分析表明，存在RHD基因的第1、7、8、9、10，缺失第3、4、5和6外顯子，其基因結構與部分DVItype Ⅲ型相近。

13、[結論]： 1．RHD基因缺失，RHD因第1227位G>A Del型突變，RHD-CE-D雜化基因和一個新的933位CYA的突變是研究樣本中導致形成RhD陰性表型的四種分子機制。RHD基因缺失是引起中國漢族人RhD陰性表型形成的主要分子機理。 2．RHD因第1227位G>A Del型突變是引起基因定型和血清學定型結果不一致的主要原因。 3．中國漢族人RhD陰性個體存在與高加索人相一致的雜化Rh盒子基因序列。RHD